專家指路：如何追上CRISPR技術快速發展的腳步？

　　每個月都有一大波新的CRISPR工具來襲。比如，Cas9抑制劑的出現可在各種場景下防止脫靶效應。人們也將CRISPR-Cas9系統與前沿的單細胞測序技術相結合，開發出新的策略。與此同時，研究人員開發出Cas9以外的效應物核酸酶，比如C2c2，靶向RNA以實現編輯和成像應用。

　　對于這些熱門的技術，我們要不要追？怎么追？對此，《The Scientist》雜志請來一些開發人員，對實驗室如何采用這些最新技術提出了一些建議。

　　Cas9的“死亡開關”

　　研究人員：加州大學舊金山分校的研究員Joseph Bondy-Denomy

　　背景：盡管Cas9核酸內切酶頗受歡迎，但由于它們有時在細胞內逗留得太久，而引發脫靶效應，故研究人員正在研究Cas9的“死亡開關”。“人們的目標是有一種方法來關閉它，而不是依賴被動降解，”Bondy-Denomy說。在理想的情況下，Cas9將找到完美的靶點，而之后抑制劑防止它進行其他切割。

　　方法：Bondy-Denomy的團隊找到了四種新的Cas9抑制劑，發現其中兩種（AcrIIA2和AcrIIA4）能阻斷廣泛使用的化膿性鏈球菌Cas9的作用（Cell, 168:150-58, 2017）。研究人員發現，細菌與入侵的病毒大戰時，即使它們有CRISPR-Cas9系統也不一定能取得勝利。這時，抑制劑可能起了作用，于是研究人員著手尋找更多。

　　如何開始：Bondy-Denomy的團隊計劃在不久的將來把這四種抑制劑放在Addgene上。AcrIIA2和AcrIIA4在HEK293細胞系中起作用。不過，“任何人都可以用它們來研究他喜歡的Cas9版本，”他說。“1號和3號對我們的研究不起作用，但說不定對別人有用。”

　　至于何時使用抑制劑，他認為每個實驗的時機都是不同的。因此，用戶需要自己檢查off-target編輯是否減少或消失。當然，也要檢查on-target的情況。“我們預計一些on-target活性消失，但我們還不清楚，”他說。

　　未來：研究小組正利用向導RNA來檢驗抑制劑。有時，他們希望在特定位點固定一個點突變，這個目標后面需要跟隨著一個PAM序列。在編輯之后，PAM序列也需要改變，否則目標位點會被再次切割。這時，抑制劑實現了Cas9的瞬時激活。

　　Tip：對于擔心脫靶效應的研究人員，這里有個好消息。Takara旗下Clontech的Guide-it產品線在2016年推出一款納米囊泡（Gesicle）系統，可在提高基因編輯效率的同時，降低脫靶效應。與采用質粒或者病毒載體相比較，采用Cas9/sgRNA Gesicle進行基因編輯實驗，可以在廣泛細胞類型中高效導入Cas9蛋白質/sgRNA復合物，從而提高基因編輯效率。同時，可以嚴格控制用于細胞的Cas9蛋白質/sgRNA復合物的劑量和持續時間，從而降低脫靶效應。此產品也是2016生命科學十大創新產品評選的候選產品。

　　CRISPR + 單細胞測序

　　研究人員：加州大學舊金山分校的教授Jonathan Weissman以及Broad研究所的核心成員Aviv Regev

　　背景：與不斷擴展的CRISPR-Cas9工具箱一樣，單細胞測序技術近年來也發展迅速。研究人員提出了基于液滴的方法，而首批商業化平臺也即將上市。

　　方法：《Cell》雜志上發表的三項研究表明，人們可采用CRISPR-Cas9工具進行基因編輯和基因抑制，然后開展高通量的單細胞RNA-Seq（Cell, 167:1853-66, 2016； Cell, 167:1867-82, 2016； Cell, 167:1883-96, 2016）。

　　Weissman和Regev的新技術被稱為Perturb-seq，此系統的關鍵在于能夠在單細胞的轉錄組中確定CRISPR帶來的擾動。大多數單細胞RNA-Seq方法需要捕獲RNA 3’端的poly(A)尾，但向導RNA通常不帶有poly(A)尾，因此不能直接捕獲。于是，研究人員提出了一種條形碼策略來識別向導RNA。另一個關鍵步驟是開發一種分析管道來解析大量的數據。（延伸閱讀：Nature新技術：CRISPR+單細胞測序=？）

　　如何開始：研究人員使用10X Genomics的平臺來進行單細胞RNA-Seq，這對許多人來說還有點陌生（延伸閱讀：10X Genomics發布升級版測序平臺）。不過，Norman表示，Perturb-seq也可以在96孔板中進行，使用Drop-seq方法。此外，你應當使用你喜歡的Cas9變體。

　　他們添加條形碼和表達向導RNA的載體很快就能通過Addgene獲得。利用這種方法，研究人員在理論上能夠集中不同實驗的細胞，以便降低成本。數據分析可以在標準的計算集群上完成；不過請做好心理準備，挖掘數據可能至少需要幾個月的時間。

　　未來：Weissman的團隊計劃發布一個更詳細的實驗方案，他和Regev的團隊將發布他們開發的一些計算工具。他們希望這項技術變得觸手可及。

　　歸巢向導RNA（hgRNA）

　　研究人員：加州大學圣地亞哥分校的生物工程系助理教授Prashant Mali和哈佛醫學院的遺傳學教授George Church

　　背景：譜系追蹤對發育生物學至關重要。在過去的一年中，幾個研究小組已采用CRISPR-Cas9方法來追蹤細胞命運。他們在細胞發育過程中追蹤基因組中的Cas9編輯。

　　方法：最新突破是歸巢向導RNA（homing guide RNA，hgRNA），它指導Cas9到達自己的DNA位點，從而切割自身。這可作為一個多樣化的條形碼，讓Mali和Church的團隊追蹤培養的細胞群體。這種方法是獨特的，因為經過編輯的hgRNA保留了靶向自身的能力，故它們的壽命可能比其他用于譜系追蹤的條形碼更長。此外，條形碼被轉錄，因此研究人員可以利用RNA檢測方法來讀取它們，比如Church實驗室開發的熒光原位RNA測序（FISSEQ）。Mali在最新的文章中詳細介紹了這種條形碼（Nature Methods, 14: 195-200, 2017）。

　　如何開始：Mali認為，這種工具實際上很容易實現。它歸結為創造細胞，并融入特定的條形碼。檢測也不一定是FISSEQ，任何單細胞測序方法也許都有效。與標準的向導RNA一樣，歸巢向導RNA也需要從實驗上檢驗。在切割時形成的一些自發突變有可能引發大的插入或缺失，并破壞歸巢活性。“找到適合你應用的組合將是至關重要的，”Mali說。例如，如果你想要追蹤多次細胞分裂，那么你需要一個停留更長時間的向導。“至少在這一刻，我們還沒有如何選擇最佳hgRNA的確切規則，”他說。

　　未來：從理論上說，這些條形碼可產生足夠數量的變體，覆蓋整個小鼠大腦中的各種細胞類型。研究小組目前的重點是在體內進行研究。

　　對RNA下手

　　研究人員：Broad研究院的核心成員張鋒（Feng Zhang）以及國立衛生研究院的高級研究員Eugene Koonin

　　背景：常規的CRISPR-Cas9對研究那些轉錄但不翻譯的基因（即非編碼基因組）不是太理想。若能直接操控RNA，研究人員將更好地了解RNA，并開發出基于RNA的療法，如抗病毒藥物。

　　方法：在一項概念驗證研究中，張鋒與Koonin的團隊合作研究了新的CRISPR效應物C2c2，它切割單鏈RNA中的特定目標（Science, 353:aaf5573, 2016），并降解細菌中的特定mRNA。兩個研究小組發現了許多不同“風味”的C2c2。通過與其他人合作，他們正在研究這16個直系同源物，并在不同應用中檢驗它們。

　　與抑制基因表達的RNA干擾工具不同，C2c2可定位在細胞內。“你可以把它帶到細胞核中，讓它在那里發揮作用。它將成為探索非編碼基因組的有力工具，”張鋒課題組的研究生Omar Abudayyeh說。

　　如何開始：原始的C2c2質粒可以從Addgene處獲得，不過需要注意的是，它并不是針對哺乳動物細胞的使用而優化的。它更有可能在細菌中起作用，或者植物，但他們還沒有嘗試過，Abudayyeh說。

　　即使是目前的直系同源物，在嘗試靶向某個轉錄本時，還是存在差異。這不僅是因為序列本身，還在于轉錄本是否可接近。許多轉錄本有二級結構，或與蛋白結合而掩蓋了序列。為了解決這個問題，他們建議用多個均勻間隔的向導來鋪滿你的目標。此外，預測RNA結構的計算工具可能有助于你了解特定目標的成功可能。當然，重點是檢查蛋白質表達情況，以確定C2c2是否起作用。

　　未來：除了鑒定C2c2的新同源物，Broad的研究人員正在開發guide-tiling芯片，這有點類似于芯片，不過用寡核苷酸探針作為向導，目的是開發出一組規則，能夠幫助人們預測向導的成功可能。