慢病毒大規模生產面臨的挑戰

　　慢病毒作為基因載體在治療各類遺傳性和后天性的人類疾病中倍受歡迎。從基礎研究發展到臨床階段，高濃度純化的載體需求量越來越大，相應的方法也層出不窮。目前大多數慢病毒的生產是在方瓶、平皿等體系中加入胎牛血清貼壁培養HEK293細胞系（293T和293E），通過多質粒瞬時轉染包裝得到病毒，但是該方法難以放大生產。

　　瞬時轉染的放大培養包括貼壁細胞和懸浮細胞。

　　對于貼壁細胞培養放大，如使用滾瓶和細胞工廠，這些方式依靠增加培養單元數目來增大細胞量，往往占場地且勞動量大。為解決這些問題，人們開發了中空纖維生物反應器、固定床生物反應器、微載體培養等方式。中空纖維生物反應器含有數千根毛細管，將空間分成了兩部分：纖維外培養細胞，纖維內運輸培養基并進行營養物和代謝物的交換。固定床生物反應器由密集的微纖維載體組成床層，支持貼壁細胞的高密度生長。培養基灌注穿過床層，將營養物、氧氣的交換給細胞。微載體培養通常是細胞貼附在100-200 μm的實心或多孔球形載體上。相比傳統的二維培養，微載體給細胞提供了更大的表面和三維的培養空間。盡管微載體培養有一定的優勢，比如易于分離細胞和產品，但仍不能消除勞動強度大的問題。

　　要獲取大的生長面積同時減少勞動量，一個方法就是使生產慢病毒的細胞株適應懸浮培養。使用懸浮培養可以比貼壁培養大大提高細胞密度而不需要貼附的表面，如在搖瓶、攪拌式反應器中；另一大優點是細胞可以在無血清培養基中培養，減少終產品中潛在的免疫原性物質污染和動物源的組分，簡化下游純化工藝，這就大大推進了產品向臨床級別轉變。懸浮培養的放大相比原先通過增多單元量進行的貼壁培養，也可以減少批次間的差異。

　　目前已有研究在攪拌式生物反應器和波浪式生物反應器中通過瞬時轉染懸浮HEK293細胞成功生產慢病毒。且研究表明懸浮體系與傳統貼壁體系的慢病毒滴度相當，在106-108TU/ml (Segura et al., 2007； Ansorge et al.,2009)。

　　要配合更大規模的慢病毒生產，還需要下游的加工技術和質量分析進一步保障。下游加工技術須符合以下標準：可放大、經濟性、高通量、可高效清除雜質、保持病毒的功能性，并盡量減少病毒顆粒損失。常見的慢病毒載體純化濃縮方法是通過離子交換色譜和分子排阻色譜。雖然也有一些其他方法被開發，如親和吸附、超速離心、切向流過濾等，但不是所有方法都時候大規模應用。目前，慢病毒載體產品質量尚無統一的國際標準。生產人用的GMP級慢病毒載體需要嚴格分析，以保證其純度、效價和安全性。純度檢查要保證雜質的含量水平不會引起毒性和接受者的免疫反應；效價檢測是保證臨床使用時單位劑量的慢病毒載體轉導效率一致；而安全性檢查則保證復制缺陷的慢病毒載體沒有發生同源重組，變成有復制能力的病毒。

　　在過去的十年中，慢病毒進入了我們的視野。如今，大規模的慢病毒生產已有相當的進展，正是這些研究的迫切說明其還有更大規模的需求。慢病毒大規模生產過程的發展是加速基因治療、細胞治療驗的關鍵，它將推動人類以更有效的方式治療一系列疾病。