顛覆傳統觀點，逆轉疾病：Nature公布CRISPR重要成果

　　在人體和小鼠體內，如果Tmc1-a出現異常，那么內耳中負責感應聲波振動的關鍵細胞：毛細胞（hair cells）就會受損，從而造成耳聾。來自哈佛大學的一組研究人員利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術，剔除了該基因的突變拷貝，從而減少了小鼠聽力損失。這一研究成果公布在12月20日的Nature雜志上。

　　領導這一研究的是哈佛大學化學生物學家David Liu，作為納斯達克CRISPR“第一股”Editas公司的聯合創始人之一，David R。 Liu也是最早著手于CRISPR科研的幾位科學家之一，據稱這位教授是一位從來沒有做過博士后的年輕教授，他早年畢業于哈佛大學，1999年在加州大學伯克利校區攻讀博士學位，在Peter Schultz教授指導下從事核糖核酸研究，并自主首次開始活細胞遺傳密碼的研究。之后就被哈佛大學任命為助教授，2004年晉升為教授。Liu教授曾被麻省理工學院技術評論列入全球Top 100 青年發明家（35歲以下），“大眾科學”亦將其列入全美Top10最具才氣的青年科學家。

　　對于這項最新成果，Liu表示，“這一領域的傳統思維是，一旦你失去了內耳毛細胞，就很難再讓它們回來了”，“我認為，當可以實現時，基因組編輯藥物的瞬時傳輸性質特別有前途。像是眼睛和耳朵這樣可通過局部注射進入的器官組織，這種局部RNP傳輸確實具有一些真正的優勢。”

　　來自俄勒岡健康與科學大學的感官生物學家Peter Barr-Gillespie（未參與該項研究）認為“這是一項非常重要的工作。研究表明，CRISPR介導的基因編輯可以真正改善體內的聽力損傷。”

　　TCM1基因突變

　　耳朵是一種復雜的機器，可將機械聲波轉換成大腦處理的電信號。當聲波進入耳朵后，內耳毛細胞不均勻的兩端（纖毛）被推回，就像被大風壓彎的一棵草。這一活動會引起連接靜纖毛的成串蛋白質（纖毛尖端細絲連接蛋白）產生張力，并通過貫穿毛細胞束末端的離子通道，向大腦發出一種信號。人體內耳聾最常見的原因是內耳毛細胞受到損傷，當毛細胞受損，耳蝸螺旋神經節神經元就會開始退化，無法行使功能。細胞移植可以替代毛細胞工作，但如果感覺神經元被損傷，那么聽覺仍然是有限的。

　　很早之前，科學家們就知道TCM1基因突變可導致耳聾，并在之前的研究中，他們逐漸發現其編碼的蛋白質TMIE，與靜纖毛尖端細絲連接蛋白質能相互作用，并將纖毛尖端連接與離子通道附近的一個組件聯系起來，也就是說TMIE在纖毛尖端細絲連接和離子通道之間發揮橋接的作用，如果沒有TMIE，毛細胞在刺激后就不會誘發電信號。TCM1發生了一種顯性負性錯義突變后，會導致內耳毛細胞單通道電流水平和鈣滲透率降低，進一步導致感音神經性語后聾（語言形成后出現耳聾）。通常，TCM1顯性突變患者在10-15歲時會開始逐漸變聾。

　　CRISPR基因編輯介入：不同的傳遞方式

　　在最新這項研究中，研究人員設計了一種特殊的小鼠模型：貝多芬小鼠模型，之所以起名為貝多芬，當然是來自于這位耳聾的杰出音樂家（雖然貝多芬耳聾的原因并不是基因突變）。在這種小鼠中同樣存在引發人體耳聾的TMC1基因突變，小鼠逐漸失去了一些聽力，并且由于毛細胞的死亡，到八周時它們完全失聰了。

　　David Liu及其同事設計了一個導向RNA，靶向致病基因拷貝（常染色體顯性遺傳基因），從而健康的那個等位基因能發揮功能。不過這項研究并沒有像常規一樣采用基于病毒的系統，傳遞Cas9和導向RNA序列，研究人員選擇利用脂質包裹和傳遞Cas9指導RNA核糖核苷酸蛋白（RNP）復合物。這一策略改善了突變等位基因的編輯選擇性，使其在小鼠成纖維細胞培養物中的靶向性比野生型等位基因多出了20倍。

　　接下來，他們將脂質RNP復合物注入新生的貝多芬小鼠一只內耳中，這個小鼠具有一個貝多芬等位基因和一個野生型等位基因，研究人員也留下一邊耳朵未注射，作為內部對照。注射后的耳朵出現了完整的健康毛細胞，但未治療的耳朵在八周內出現了快速的毛細胞死亡。

　　“這令人興奮，”Liu說，“因為這表明比較于未治療耳朵，我們保證了了毛細胞的健康和豐度。”

野生型小鼠的耳蝸（右圖），攜帶一個常染色體顯性貝多芬等位基因拷貝的小鼠的未經治療的耳朵（左圖）和經治療的耳朵（中圖）。未經治療的耳朵中內耳毛細胞（IHC）和外毛細胞（OHC）（綠色）缺失，粉紅色數字表示每個段檢測到的近似頻率（以kHz為單位）。

　　研究人員通過監測聽覺腦干反應（ABR）（一種對聲音的神經反應的測量）來測試四周齡小鼠的聽力。未經治療的耳朵記錄了75到80分貝左右的ABR，與噪音處理量相當。經過治療的耳朵可以聽到安靜的約60分貝的聲音，相當于一個安靜的談話。野生型小鼠可以聽到低至30至40分貝的聲音，這表明基因組編輯能部分避免聽力損失。治療八周后，治療組的ABR閾值仍低于未治療組，但此時的ABR要高于四周時的情況，這說明小鼠的聽力還是出現了變化。

　　Barr-Gillespie表示：“野生型小鼠的閾值遠遠不夠，但是10-15分貝對人體來說是一個巨大的變化。這種聽力損失在人體內是非常明顯的，治療可以使生活質量得到實質性的改善。”

　　比利時列日大學的神經科學家Brigitte Malgrange說，“這對治療遺傳性耳聾來說，確實是一個非常重要的結果。目前還只是在小鼠階段，因此下一步就需要在人體中進行嘗試。”

　　約翰霍普金斯醫學院的神經科學家UlrichMülle（未參與該項研究）警告道：“問題在于這項技術的適用范圍有多大”。他解釋說，許多遺傳性耳聾早在人胎兒發育期間就會出現，因此這對這種基因組編輯的傳遞策略更具挑戰性。但是，相比于依靠持續性病毒感染的輸送策略，這種RNP傳輸方法減少了脫靶效應，這也許會是一個很好的選擇。