液相芯片技術的原理與應用

液相芯片，也稱為微球體懸浮芯片（suspension array，liquid chip），是基于xMAP（flexible MultiAnalyte Profiling）技術的新型生物芯片技術平臺，它是在不同熒光編碼的微球上進行抗原抗體、酶底物、配體受體的結合反應及核酸雜交反應，通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的，一個反應孔內可以完成多達100種不同的生物學反應，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術平臺。迄今為止十年時間，全球已有數百套基于xMAP技術的檢測平臺用于免疫學、蛋白質、核酸檢測、基因研究等領域，該技術已成為一種新的蛋白質組學和基因組學研究工具，也是最早通過美國食品與藥物管理局（FDA）認證的可用于臨床診斷的生物芯片技術。　

1  液相芯片技術的原理

　　液相芯片體系由許多大小均一的圓形微球（直徑5.5～5.6 μm）為主要基質構成，每種微球上固定有不同的探針分子，將這些微球懸浮于一個液相體系中，就構成了一個液相芯片系統，利用這個系統可以對同一個樣品中的多種不同分子同時進行檢測，這種被稱之為xMAP的檢測技術是1997年由美國Luminex公司開發出來的。

　　在液相系統中，為了區分不同的探針，每一種固定有探針的微球都有一個獨特的色彩編號，或稱熒光編碼。在微球制造過程中摻入了紅色和橙色兩種熒光染料（這兩種染料各有10種不同區分），從而把微球分為100種不同的顏色，形成一個具有獨特光譜地址的含有100種不同微球的陣列。不同顏色微球在分類激光激發下產生的熒光互不相同，這種分類熒光是識別不同微球的唯一途徑。利用這100種微球，可以分別標記上100種不同的探針分子。

    檢測時先后加入樣品和報告分子與標記微球反應，樣品中的目的分子（待檢測的抗原或抗體、生物素標記的靶核酸片段、酶等）能夠與探針和報告分子特異性結合，使交聯探針的微球攜帶上報告分子藻紅蛋白，隨后利用儀器（如Luminex 100）對微球進行檢測和結果分析。Luminex 100采用微流技術使微球快速單列通過檢測通道，并使用紅色和綠色兩種激光分別對單個微球上的分類熒光和報告分子上的報告熒光進行檢測。紅色激光可將微球分類，從而鑒定各個不同的反應類型（即定性）；綠色激光可確定微球上結合的報告熒光分子的數量，從而確定微球上結合的目的分子的數量（即定量）。因此，通過紅綠雙色激光的同時檢測，完成對反應的實時、定性和定量分析。

2  液相芯片技術的優點

　　液相芯片技術最突出的優點在于：僅需少量樣本即可同時定性、定量檢測同一樣本中的多種不同目的分子，即多重檢測（multiplexing）。具體說來，與常規免疫學或核酸檢測方法相比，液相芯片技術具有以下顯著優點。

    2.1  高通量

    可對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行實時、定性、定量分析。從理論上說，如果不存在交叉反應，檢測的通量等于微球的種類數，目前最多可達到100種。這遠勝過一次只能檢測一個項目的傳統免疫分析法。

    2.2  樣本用量少

    由于在同一個反應孔中可以同時完成100種不同的生物學反應，所以大大節省了樣本用量，少至1μl的樣本即可檢測，非常適合分析小體積稀有樣品。

    2.3  操作簡單、快速

    由于是基于液相反應動力學，因此反應速度快，孵育時間比傳統的固相檢測短。進行免疫學分析時，若使用高親和力抗體，2～3 h內即完成檢測，而核酸雜交分析在PCR擴增后1 h內可得到結果。

    2.4  靈敏度高

    微球表面積大，每個微球上可包被100 000個捕獲抗體，如此高密度的捕獲抗體保證了能夠最大程度地與樣本中的抗原分子結合，提高檢測靈敏度。最低檢測濃度可達到0.1 pg/ml.

    2.5  檢測范圍廣

    可達3～5個數量級（如BioRad公司細胞因子檢測試劑盒的檢測范圍達到0.2～32 000 pg/ml，樣品無需濃縮或稀釋。

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    2.6  特異性強

    無需洗滌就能夠自行將和微球結合的與未結合的分子區分開來，只讀取單個微球上的熒光信號，信噪比好。

    2.7  準確性高

    微球上的報告分子熒光強度與結合的待測分子成正比。由于液相芯片技術的檢測范圍大，因此不需要象ELISA檢測中那樣需將樣本多倍稀釋，從而減小了誤差。

    2.8  重復性好

    這是由于：第一，與ELISA依靠酶放大作用的比色讀數相比，液相芯片技術中的熒光讀值更加直接、穩定、靈敏；第二，每種微球檢測100個，最終取熒光強度的中值作為結果，這相當于對每個樣本重復檢測了100次，而ELISA僅為雙復孔或三復孔，因此液相芯片檢測結果的準確性和重復性是ELISA無法比擬的。

    2.9  費用低

    同時檢測一個樣本中的多項指標可節約時間、樣本、試劑、耗材和勞動（比ELISA法低10～100倍），降低檢測成本，同時還提高了分析效率，僅需少量樣本即可獲得大量信息。目前同時檢測10項細胞因子的液相芯片試劑的費用大約為＄1300/96孔（＄130/項/96孔），這比檢測單項指標的ELISA試劑的成本（＄500/項/96孔）低得多，而且還可隨檢測指標的增加而進一步降低費用。

    2.10  靈活

    適用于各種蛋白質和核酸的分析。商品化試劑盒的使用者只需增減探針交聯微球和標記分子即可滿足不同檢測項目的需要。

3  液相芯片技術的應用進展

　　液相芯片是繼平面芯片之后的一種新型芯片技術，是一種非常靈活的多元分析平臺，在核酸、蛋白質等生物大分子的大規模分析中具有巨大的應用潛力，可用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體配體識別分析等眾多領域的研究，蛋白質蛋白質相互作用、蛋白質核酸相互作用分析等都可以在同一個平臺上實現。鑒于液相芯片技術在高通量定性和定量檢測上令人矚目的優勢，目前它在基因組學研究、蛋白質組學研究、藥物開發、基礎研究和臨床診斷等方面的應用十分廣泛，近幾年來以此為平臺的產品開發和應用十分活躍，研究者既可以根據研究需要自行制備探針交聯微球，建立反應體系，也可使用種類繁多的商品化試劑盒進行分析。大體說來，液相芯片技術的應用包括兩大部分：液相蛋白芯片和液相基因芯片，前者主要是基于抗原抗體反應，而后者實質為核酸雜交。現將液相芯片技術在檢測細胞因子、病原微生物、基因突變以及HLA、基因表達分析、細胞信號轉導途徑研究等方面的應用綜述如下：

    3.1  定量檢測細胞因子

　　細胞因子參與多種免疫機能，某些細胞因子具有相同功能，并且調節其它細胞因子的合成和分泌，因此同時檢測多種細胞因子有利于全面判斷機體免疫功能、了解分子水平的免疫調節機制，在疾病的診斷、病程觀察、療效判斷及細胞因子治療監測方面有重要意義，還可用于研究發病機制、藥物作用機理和藥物臨床試驗。

　　目前最常用于檢測體液和細胞培養上清中細胞因子的方法有ELISA、TRFIA等，這些方法靈敏度、特異性和準確性都較好，但是也存在一些局限：每次僅能檢測一種細胞因子，如果需要同時分析多種細胞因子，則檢測費用較為昂貴并且費時，完成檢測所需的樣本量較大，非常浪費，對于一些量少的樣本（如鼠血清、兒童患者標本）就比較困難。能夠同時檢測數種細胞因子的方法有RTPCR、Northern Blot等，但它們均不能準確定量分泌性細胞因子，而且每次檢測的細胞因子數目有限。

　　用傳統方法檢測多種細胞因子時，要求的樣品量多，費用高，ELISA的檢測范圍僅1～2個數量級，而液相芯片可同時檢測同一樣品中的多種分子，而且具有特異、快速、靈活、重復性好的特點，其檢測范圍為3～4個數量級，檢測靈敏度也遠勝于ELISA，其優勢是顯而易見的。因此定量檢測細胞因子成為目前液相芯片技術應用最為活躍和廣泛的領域之一，尤其是2004年以來，隨著市場上越來越多的商品化試劑盒的涌現，液相芯片技術檢測細胞因子的文獻報道數量迅猛增加，大有取代常規ELISA方法之勢。

    de Jager［1］自行制備抗體交聯微球，同時檢測了人血漿和關節滑液中的30種細胞因子、趨化因子和粘附分子，其檢測靈敏度為1.0～26.4 pg/ml，檢測范圍達4個對數值；檢測添加上述分子正常人血漿的回收率為83%～119％，平均批內變異系數為8.1％，平均批間變異系數為11.4％；液相芯片與ELISA法檢測結果的相關系數R2為0.88～0.99。

　　國外多家公司已推出了商品化的細胞因子液相芯片檢測試劑盒，比如R&D 公司的Flurokine MAP系列、Linco Research公司的LINCOplex 試劑盒、BioSource公司的Antibody Bead Kit、BioRad公司的BioPlex系列等，可用于來自人、小鼠、大鼠的樣品，既有一次檢測單種細胞因子的試劑盒，也有預先混合多種細胞因子抗體交聯微球而一次檢測多個指標者，研究者還可根據自身需要自行選購某幾種交聯微球。這些試劑盒在檢測靈敏性、準確性、可靠性等方面都具有很好的性能，如BioRad公司的BioPlex細胞因子檢測試劑盒，其靈敏度可達2～4 pg/ml，最高檢測濃度可達16 000～32 000 pg/ml，線性檢測范圍為3～5個數量級，批內和批間變異系數小于10％。不過這些試劑盒均未獲得FDA用于體外診斷的批準，僅限于實驗研究用途。如Funding［2］ 用BioRad公司的BioPlex試劑盒同時定量測定角膜移植排斥患者房水中的17種細胞因子，發現這些患者的細胞因子水平顯著增高。Szodoray［3］用Biosource公司的試劑盒檢測了9名原發性Sjogren綜合征患者血漿中可能與細胞死亡有關的25種細胞因子水平，發現某些細胞因子水平在患者與健康人之間差異顯著，作者認為能同時檢測多種細胞因子的液相芯片技術可成功用于診斷Sjogren綜合征及個性化抗細胞因子治療。

　　與傳統ELISA方法相比，液相芯片除了能同時檢測細胞培養上清、血清、血漿、全血、組織勻漿液、淚液、腦脊液甚至新生兒干血斑等標本中的多種細胞因子，一次檢測即可確定Th1/Th2特異性免疫應答，能為了解免疫應答中的細胞因子分泌情況提供更為全面的信息外，還至少具有以下優點：①比ELISA靈敏度更高，標準曲線在更低的濃度仍能保持線性：這是因為液相芯片與ELISA依靠酶放大作用的間接檢測相比，熒光讀值更直接、穩定、靈敏；此外，液相芯片檢測中洗滌更徹底，微球表面積小，減少了非特異性結合；而且交聯抗體是共價結合于微球上，這不同于ELISA依靠疏水作用通過物理吸附與固相載體結合。②比ELISA更準確：液相芯片最后報告的熒光值為100個微球熒光檢測結果的中值，相當于重復進行了100次檢測。③更經濟：一次可對10～20余種細胞因子進行定量分析，檢測單種細胞因子的試劑用量顯著降低，樣本需要量少（最多僅需100 μl），而ELISA檢測同樣數目的細胞因子需要數毫升樣本。據估算，同時檢測8種人細胞因子的費用僅為ELISA的1/17，樣品用量僅為后者的1/20，因此大大節省了人力、時間和費用。

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    3.2  檢測SNP

　　單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP) 是指在基因組水平上由于單個核苷酸改變所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知遺傳多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1 000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。隨著人類基因組計劃的完成，基因組多態性研究，尤其是SNP檢測，已經成為一個重要的研究熱點。

　　利用液相芯片技術進行SNP分析的研究報道已有很多，在此平臺上可應用多種不同的SNP基因型分析方法，如單堿基鏈延伸法（single base chain extension，SBCE）、等位基因特異性引物延伸法(allelespecific primer extension，ASPE)、寡核苷酸連接法、直接雜交法、競爭雜交法等。

　　采用液相芯片技術進行SNP分析，96孔板上每孔可檢測50種SNP，儀器分析96個孔的數據只需1小時，這樣每臺儀器每天（8h）可完成30 000個以上基因型的檢測，每個SNP的平均檢測費用據估算不到＄0.20（不包含PCR費用），并且主要取決于SNP數目、聯檢項目數量、標本數量、人力和試劑費用等因素。因此，用液相芯片進行SNP分析比DNA測序或者基因芯片操作簡便、快速、高效、準確、重復性好、通量高、費用低，而且單管反應即可檢測多種SNP，在研究SNP與疾病（心血管疾病、肥胖、腫瘤等）發生、法醫鑒定等方面具有顯著的優勢和廣闊的應用前景。Nishihama［4］ 為評價有或無冠心病常見危險因素（高血壓、高血脂、糖尿病）者基因多態性與心肌梗塞之間的關聯，采用液相芯片法（PCR與序列特異性寡核苷酸探針雜交）確定了3 483人（1 192名心肌梗塞患者、2 291名對照）137個候選基因的164種多態性的基因型，發現9種不同的多態性與心肌梗塞顯著相關（P<0.005），冠心病常見危險因素不同者其心肌梗塞相關基因多態性也不同。

　　目前也已推出用于SNP檢測的液相芯片試劑盒，如Tm Bioscience公司有用于臨床同時檢測因子V Leiden突變（G1691A）、凝血酶原（G 20 210 A）、MTHFR C677T和MTHFR A1 298 C突變、檢測導致囊性纖維化的CFTR基因突變的遺傳性疾病檢測試劑盒（囊性纖維化檢測試劑盒是被FDA批準的首個人類疾病多重基因分型體外診斷試劑），很適合用于高通量臨床基因分型。Marligen Biosciences公司的YSNP鑒定系統和線粒體DNA篩選系統可分別檢測人Y染色體上的96種SNP和人線粒體DNA超變區的30種SNP。

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    3.3  檢測病原體和診斷感染性疾病

　　應用液相芯片技術不僅可用免疫學方法檢測機體感染病原體（包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲等）后產生的血清抗體，或直接檢測病原體抗原，也可在基因水平上檢測病原體的核酸，其用途十分廣泛，如血清學診斷、病原體分型、疫苗效力評價、食品安全、環境監測、生物反恐等。這方面的研究報道很多，一般都將液相芯片和傳統的金標準ELISA法進行檢測結果比較。

    3.3.1  血清學診斷  檢測抗病原體特異性抗體時一般采用間接法，即將病原體抗原（蛋白或多糖）交聯在微球上，與樣品中的相應抗體結合后，加入藻紅蛋白標記的抗人IgG或IgM.

    Lukacs［5］ 制備了抗原交聯微球，不需洗滌步驟即可同時檢測新生兒干血斑標本中的乙肝表面抗原、HIV1 p24、gp41抗體和丙型肝炎病毒NS3、NS4、核心抗原的抗體。Martins［6］在微球上交聯A組鏈球菌的9種不同抗原（包括2種非特異性細胞外抗原、3種特異性抗原和4種與急性風濕熱有關的組織抗原），定量分析患者感染A組鏈球菌后血清中的抗體反應。該方法僅需5 μl血清，90 min即完成分析，對鏈球菌溶血素O（SLO）、DNaseB的測定結果與傳統方法100％相符，而且特異、靈敏，可檢測濃度1 ng/ml以下的抗體。Kuller［7］直接在微球上交聯全病毒抗原，用液相芯片技術檢測恒河猴血漿中的抗病毒IgG抗體，以篩選未感染猴D型逆轉錄病毒、猴T淋巴細胞趨向性病毒、猴皰疹病毒1型、猴免疫缺陷病毒的SPF動物，并與ELISA比較檢測靈敏性、特異性、交叉反應性和通量。結果表明，這兩種方法的檢測結果高度相關（相關系數 r 為0.98～0.99），液相芯片靈敏度更高，卻又不影響其特異性（達100％），不產生交叉反應，而且由于該方法的假陽性率低，因而可減少需用Western確證的血清樣品數量。在時間方面，用液相芯片同時檢測樣品中抗4種病毒抗體所需的時間與ELISA檢測抗單種病毒抗體所需時間相等。因此液相芯片在靈敏度、穩定性、通量等檢測性能方面較ELISA更勝一籌。此外還有用液相芯片技術檢測鼠疫桿菌、炭疽桿菌、EB病毒、西尼羅河病毒、流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、弓形體、小隱孢子蟲等病原體特異性抗體的報道。

    3.3.2  病原體的檢測和分型  人乳頭瘤病毒（HPV）可導致宮頸癌，宮頸癌是婦女的第二大腫瘤，每年死亡人數近250 000人。HPV感染后患宮頸癌的危險性與病毒型別有關。Schmitt［8］采用液相芯片技術實現了在一個反應中同時對22種高危型和低危型生殖道HPV的基因分型，它是通過PCR以及與交聯在微球上的型特異性探針雜交而完成。其批間變異系數<10％，最低檢測限為100～800 pg PCR產物。該方法與反向線點雜交法對94個臨床標本的檢測結果相符，而靈敏度更高。Wallac［9］也通過類似方法同時高通量、快速檢測45種生殖道HPV的基因型。由于液相芯片法對檢測HPV混合感染非常有效，因此十分適合用于常規診斷、大規模流行病學調查、腫瘤篩查、監測治療干預效果及疫苗試驗中評價疫苗效果等。Borucki［10］在液相芯片技術中引入了DNA樹形大分子（dendrimer）信號放大方法，只使用基因組DNA即對單核細胞增生性李斯特菌菌株進行了血清型鑒定，該方法不需PCR擴增，而且與多重PCR不同的是，它易于通過設計更多針對不同區域的探針序列而提高分型的分辨率。

　　Straub［11］先采取自動化的免疫磁珠分離技術從樣品中分離大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌，然后通過標記引物進行多重PCR，最后用液相基因芯片同時檢測上述三種細菌。結果表明其檢測限為100個菌/種。

　　用液相芯片技術進行病原體基因檢測和分型鑒定可將核酸雜交分析的特異性、可靠性及液相芯片技術的快速、靈敏性結合起來，PCR 1 h后即可完成鑒定，能精確區分相差一個核苷酸的不同種屬細菌，靈敏度達到101～103基因組拷貝或<1 pg DNA。

    3.3.3  疫苗效力評價  在用于疫苗臨床試驗，尤其是評價多價疫苗接種后的免疫應答反應方面，液相芯片技術非常適合同時測定同一血清樣本中的多種微生物或多種血清型的特異抗體，與傳統的ELISA相比，在檢測結果上相關性好，更加靈敏，最低檢測濃度可比ELISA低100倍，動態檢測范圍更寬，不必檢測多種稀釋度的血清，從而可提高檢測的準確性，更能大大減少操作和時間，節約樣品用量和費用。Villa［12］用液相芯片法在一項隨機、雙盲、安慰劑對照的多中心Ⅱ期試驗中測定特異抗體水平，評價預防性四價HPV疫苗（HPV 6、11、16、18）的效果。Komatsu［13］用液相芯片技術檢測腫瘤患者經腫瘤肽疫苗免疫接種后的血清抗肽抗體水平，該方法可迅速、準確地測定這6種抗肽抗體，檢測結果與ELISA大致相同，它不僅與ELISA同樣靈敏，而且血清樣品用量少，檢測成本低，耗時短。以檢測100種抗肽抗體計算，液相芯片僅需血清1.5 μl，而ELISA需要900 μl；此外，液相芯片成本大約為ELISA的1/10，而檢測1000名患者血清所需時間僅為ELISA的1/240。還有許多其它相關研究，如同時定量檢測破傷風、白喉類毒素、流感嗜血桿菌B型多糖血清抗體，4種腦膜炎球菌血清型的血清IgG，23種肺炎球菌莢膜多糖血清型特異性IgG抗體等。

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    3.4  HLA分型

　　人類白細胞抗原（HLA）是目前所知人體最復雜的遺傳多態系統，HLA不但與個體對某些疾病（如強直性脊柱炎）的易感性有關，其最重要的用途還在于器官移植之前的組織配型。傳統的血清學和細胞學配型檢測方法耗時較長，難以快速向臨床醫生報告結果，而液相芯片技術為其提供了一個更好的選擇，既可以用血清學方法檢測抗HLA抗體，也可用分子生物學方法直接檢測等位基因。

　　利用液相芯片技術進行HLA血清學分型的靈敏度高于ELISA，而且還具有ELISA所不能比擬的高通量、省時和高效率，如ELISA 3 h僅能檢測10個標本，而液相芯片可做94個標本，非常適用于臨