Waters高效液相色譜柱簡單介紹與選擇

生產高效液相色譜柱的廠家有很多，如Waters，Agilent，Phenomenex，Shimadzu，Thermo等，每家供應商又生產多個系列，導致市場上的液相色譜柱的可選擇性極強。

目前實驗室以及公司，企業使用最多的是Waters以及Agilent所生產的RP液相色譜柱。Waters主要有Symmetry，Sunfire，XTerra，XBridge，XSelect，CORTECS以及Atlantis系列等，其詳細分類以及鍵合相如下。

Figure 1 Waters Symmetry column family

Figure 2 Waters Sunfire column family

Symmetry與Sunfire系列色譜柱使用高純度硅膠（B型）作為固定相基質，摒除金屬離子雜質對固定相Si-O鍵的促進水解作用，此外由于金屬離子含量特別低，在對其表面鍵合選擇性烴基或內嵌極性官能團烴基時，可通過配體添加量控制硅膠表面鍵合相的多少，因此其最大特點在于批次之間的重現性。兩個系列均采用封端技術，Sunfire C8與C18表面載碳量分別為12%和16%；SymmetryC8與C18載碳量均為12%，因此兩個系列的C8色譜柱對于分析物的保留能力上沒有本質的區別，而Sunfire C18色譜柱則相比Symmetry C18色譜柱，對于非極性比較大的分析物具有更強一些的保留能力，當然對于有機相的最低比例也相對比較高一些。Symmetry C8 Prep與C18 Prep色譜柱的填料粒徑為7 um，其設計用途為制備；Symmetry300 C18（孔徑300埃，載碳量8.5%） 與Symmetry300 C4（孔徑300埃，載碳量2.8%）則是為生物大分子多肽以及蛋白質的分離，分析而設計。Symmetry Shield RP 18內嵌極性官能團色譜柱，由于在靠近硅膠表面的極性官能團的存在，增加了硅膠表面的水分子濃度，改善了與水之間的浸潤狀況;因此可以允許使用極高水相作為分離，分析條件，而不會出現孔隙內去濕現象，對于分析堿性等大極性分析物而言，減少其保留能力，改善峰形，具有很高的方法重現性。此外，Sunfire Silica 色譜柱則是純粹的高純硅膠柱，作正相使用。

Sunfire以及Symmetry系列色譜柱是Waters比較早期一些的色譜柱，均使用高純度硅膠作為固定相基質，對其表面鍵合之后，再進行封端處理；相較與HPT第一代顆粒雜化技術而言，對于極性化合物特別是堿性化合物的分析能力就顯得比較弱一些。此外，其pH允許范圍為2-8，相比采用HPT技術的Xterra系列色譜柱（pH允許范圍1-12），對于pH的耐受性比較差一些。

Figure 3 Waters XTerra column family

Xterra系列色譜柱，采用第一代顆粒雜化技術（HPT），使用超純四乙氧基硅氧烷與甲基三乙氧基硅氧烷作為起始物料合成甲基聚乙氧基硅烷，使得高純度硅膠的每三個硅羥基就有一個被甲氧基化，再次交聯與封端處理后，其表面硅羥基量減少了30%左右，且在合成雜化顆粒的同時完成封端，具有很高的批次重現性。因此，對于pH的耐受性得到了極大的提高，可耐受pH1-12。C18與RP18載碳量分別為15.5%與15%，RP8與Phenyl載碳量為13.5%與12%，粒徑可選3 um，5 um以及10 um（制備用）。C18，RP18，RP8載碳量與高純硅膠基質Symmetry以及Sunfire保持一致，但對于極性化合物的分離，分析而言，明顯提高其峰形對稱性與分析方法重現性。Phenyl色譜柱的加入，則是對C18以及C8烴基配體的一個顯著補充，可提供不同于C18以及C8的選擇性，特別適合含有苯環、萘等苯共軛結構的分析物，在疏水與氫鍵作用之外，還能與分析物起到pi-pi相互作用，對一些難分離樣品（特別是醫藥）可實現高效，快速分離，分析。其聚合物特性，質地與硅膠相比略軟，具有耐壓能力略弱，柱效相應略低的缺點。

Figure 4a Waters XBridge column family

Figure 4b Waters XBridge column family

Figure 4c Waters XBridge-XP column family

XBridge色譜柱家族是Waters液相色譜柱的當家花旦，采用最新一代顆粒雜化技術（BEH），使用超純四乙氧基硅氧烷與雙（三乙氧基甲硅烷基）乙烷作為起始物料合成聚乙氧基硅烷。與第一代雜化顆粒技術（HPT）相比，機械強度得到很大提高，Si之間額外的二乙氧基鏈接橋，使得該類型色譜柱的耐受低pH能力得到進一步提升（pH 1-12）。

其中，最常用的是三鍵鍵合的XBridge C18，C8，Phenyl柱，均采用封端處理，載碳量有所增加，分別為18%，13%，15%；單鍵鍵合TMS封端處理的Shield RP18，載碳量17%，粒徑范圍覆蓋分析到制備。酰胺柱的加入，有益于對極性化合物的分離，可明顯改善峰形，而不用使用離液序離子或者離子對試劑。Peptide C18 130埃，300埃以及C4 300埃色譜柱用于對多肽以及蛋白質類生物制品進行分離與分析。Oligo C18用于對單糖，寡糖樣品進行分析。

BEH技術XBridge XP系列色譜柱，與XBridge相比，差別在于粒徑為2.5 um，可輕松實現HPLC與UPLC之間方法的有效轉換。

Figure 5a Waters XSelect column family

Figure 5b Waters XSelect-XP column family

XSelect CSH色譜柱與XBridge色譜柱相比，區別在于前者固定相表面帶有低密度的電荷，可增強對于帶電化合物的保留能力，提高對化合物的載樣量以及提供對稱的峰形。其中五氟苯基柱在提供不同于C18，Phenyl柱的選擇能力的同時，增大極性化合物的保留。HSS型色譜柱，采用聚合物雜化顆粒，使用超純四乙氧基硅氧烷單體進行聚合，得到純度極高的合成硅膠。

其中HSS T3，HSS SB，HSS PFP，HSS CN色譜柱，為極性化合物的分離提供了多樣化選擇，其中T3采用低密度封端技術，后三種則不采用封端處理。

XSelect XP色譜柱，與XSelect相比，差別在于粒徑為2.5 um，實現HPLC與UPLC之間方法的有效轉換。

Figure 6 Waters CORTECS column family

CORTECS色譜柱固定相使用實心球技術，相比其他類型色譜柱具有快速分離，背壓較低，柱內擴散較低的特點，也具有載碳量不足，載樣量低的缺點。實際使用量遠不如其他類型的液相色譜柱。

Figure 7 Waters Atlantis column family

Atlantis色譜柱固定相使用高純度硅膠作為固定相基質，對硅羥基進行特殊封端處理（裸露硅羥基適量但不完全封端）。選擇性C18鏈采用低密度鍵合，T3采用三鍵鍵合的方式，對低pH的耐受性得到增強，dC18色譜柱采用雙鍵鍵合方式。其最大特點是在RP模式下，完全100%兼容純水相作為流動相，特別適合于增大極性分析物的保留時間。此外，Hilic Slica色譜柱為親水硅膠色譜柱，同樣兼容100%水相，其使用方法與分離原理與經典RP色譜具有一定的區別。

選擇合適的液相色譜柱是分析方法開發成功與否的關鍵，實際應用過程中可根據待分析樣品的極性與非極性大小，復雜程度，待分析樣品中各種組分的結構相似程度，分析方法開發的目的，選擇合適的色譜柱。