【新技術】銅納米簇熒光發射光譜可高靈敏度檢測酶活性

　　近年來，一種新興的納米材料金屬納米簇逐漸成為生物傳感與生物成像等領域的研究熱點。金屬納米簇通常是由兩個至幾十個原子構成的納米顆粒，尺寸一般不超過2nm，介于金屬原子和納米顆粒之間。金屬納米簇具有特殊尺寸，因此連續電子能級會分裂成離散能級使其具有特殊的光學以及電學性質。目前常用的金屬納米簇主要包括金納米簇、銀納米簇以及銅納米簇，其中銅納米簇比金、銀納米簇具備更多的優點，如成本極低、生物安全性高及反應條件更加接近生理環境等。因此，銅納米簇作為一種新型納米探針在金屬離子、生物小分子、蛋白質、核酸、酶的分析檢測以及細胞成像等領域具有廣闊應用前景。

　　近日，中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所醫學檢驗室的楊大威等科研人員以DNA為模板、硫酸銅為原料、抗壞血酸為還原劑合成了銅納米簇，并基于該銅納米簇分別實現了堿性磷酸酶及核酸內切酶的活性檢測。

　　堿性磷酸酶是一種廣泛分布在生物膜上的酶，可以催化核酸、蛋白質等分子脫掉磷酸基團。堿性磷酸酶可以參與信號傳導、細胞生長及凋亡等過程，同時可以作為肝炎、前列腺癌及骨癌的診斷標記分子。因此，實現堿性磷酸酶活性的超靈敏檢測在基礎生物學研究及臨床診斷方面均有重要意義。目前堿性磷酸酶活性檢測的主要方法為比色法、電化學法及表面增強拉曼光譜法，這些方法均需要專業的設備，且靈敏度較低。發展成本低廉、操作簡單、靈敏度高的堿性磷酸酶顯得尤為重要。蘇州醫工所科研人員首先基于合成的銅納米簇的熒光特性，實現了堿性磷酸酶活性的靈敏檢測。在這一工作中，堿性磷酸酶的存在，可以將無還原性的磷酸-抗壞血酸水解為具有還原性的抗壞血酸，進而將Cu2+還原為Cu+，繼而觸發“點擊化學”反應，生成長鏈DNA，以此為模板合成銅納米簇，通過檢測銅納米簇的熒光信號實現堿性磷酸酶的超靈敏檢測。該檢測體系的檢測范圍為0.1-40U/mL，檢測限為0.05U/mL。

　　EcoRI核酸內切酶是一種常用的限制性核酸內切酶，可以識別特殊的核酸位點，剪切磷酸二酯鍵。核酸內切酶作為一種重要的工具酶，可廣泛參與DNA復制、重組，分子克隆以及基因編輯等過程中。因此實現核酸內切酶活性的檢測在基礎分子生物學研究及臨床診斷方面均具有重要的意義。目前核酸內切酶活性檢測常用的方法包括凝膠電泳法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法、比色法以及電化學發光法，然而這些方法均具有操作復雜、原料昂貴以及靈敏度低等缺點。因此設計簡單易行、靈敏度高的核酸內切酶活性檢測方法尤為必要。蘇州醫工所科研人員以雙鏈DNA為模板合成的銅納米簇作為電信號探針，用電化學手段實現了核酸內切酶活性的靈敏檢測。在這一工作中，首先將雙鏈DNA修飾在金電極上，當核酸內切酶不存在時，以金電極上的雙鏈DNA為模板可以合成銅納米簇，銅納米簇可以溶解沉積到玻碳電極上，進而可以檢測其電化學信號。當核酸內切酶存在時，其可以識別和剪切電極表面上的雙鏈DNA，電極表面銅納米簇不能生成，即不能檢測到電化學信號。因此，在這一檢測方法中可以通過檢測電化學信號的強弱實現核酸內切酶活性的檢測，該檢測體系的檢測范圍為10-3-10 U/mL，檢測限為10-3U/mL。

　　相關研究成果發表在ACS Appl. Nano Mater.和Analyst上。該研究得到了國家重大科研裝備研制項目、國家自然科學基金等的資助。

圖1.A，銅納米簇熒光發射光譜（堿性磷酸酶濃度: 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、20、40U/mL）；B，堿性磷酸酶活性檢測標準曲線；C，檢測體系的特異性驗證；D，礬酸鈉對堿性磷酸酶活性的抑制效應。

圖2.A，核酸內切酶作用前后電泳圖及DNA不同修飾階段電化學阻抗圖；B，加入核酸內切酶前后的循環伏安圖（核酸內切酶存在a、核酸內切酶不存在b）；C，差分脈沖伏安曲線（核酸內切酶濃度：10?3、5×10?3、10?2、5×10?2、10?1、5×10?1、1、5、10、50U/mL從下到上)；D，核酸內切酶檢測標準曲線。