第二屆質譜論壇：質譜在生物醫藥中的應用分析測試百科網wiki版

發布時間：2011-07-08 19:11 原文鏈接：第二屆質譜論壇：質譜在生物醫藥中的應用

　　2011年7月7日，第二屆質譜論壇在北京師范大學英東學術講堂成功舉辦。來自北京周邊地區各研究院所、高校、檢測機構的共計300余位專家和科研人員參加了此次論壇。

　　質譜論壇由北京師范大學質譜中心發起，并得到中國質譜學會的大力支持，協辦單位為：分析測試百科網和首都科技條件平臺北京師范大學研發實驗服務基地。質譜論壇將長期定期舉辦，每年1-2期，每期將圍繞當前質譜技術應用的熱點科學問題，邀請杰出的科學家做學術報告，并提供相互間充分的交流和溝通。

　　第二屆質譜論壇的主題是質譜技術在生物醫藥中的應用。本期論壇合辦和贊助方為賽默飛世爾科技公司，分析測試百科網(www.antpedia.com) 將長期協助組織論壇，并進行宣傳和報道。此次報告邀請的專家有：中科院生物物理所楊福全研究員，清華大學生命學院鄧海騰教授，軍事醫學科學院謝劍煒研究員，以及賽默飛世爾科技公司的劉婷工程師。

質譜論壇會場

北京師范大學質譜中心主任謝孟峽教授

　　首先來自北京師范大學質譜中心主任謝孟峽教授致開幕詞。謝教授首先感謝大家的到來，接下來帶大家一起回顧了首屆質譜論壇并進行了質譜中心相關情況介紹。

　　質譜論壇的宗旨是為質譜技術在各學科的應用提供一個高層次的學術交流平臺，推動質譜技術的學科建設發展中的支撐作用。首屆質譜論壇于去年10月份舉辦后受到了社會各界的廣泛關注。首屆質譜論壇邀請的報告人有中國科學院北京基因組研究所劉斯奇研究員、中國醫學科學院基礎醫學研究所的李智立教授、北京師范大學生命學院的何大澄教授。

　　第二屆質譜論壇得到了賽默飛世爾科技的大力支持。謝老師提到，北京師范大學和賽默飛世爾的合作長達30多年，從上世紀80年代初，北師大購買的第一臺質譜就來自賽默飛世爾科技前身即菲尼根公司；之后在1999年購置菲尼根氣質聯用，2005年購置了氣相穩定同位素質譜儀，2009年購置了賽默飛世爾公司第一臺線性離子阱LC/MS等等。

　　北京師范大學質譜中心采用分散放置，統一管理的運行模式，現在運行12臺大型質譜儀器設備，分別放置在分析測試中心、生命科學學院、化學學院、環境學院、減災與應急管理研究院和二炮總醫院。儀器種類包括氣質聯用儀、氣相色譜-四極桿飛行時間質譜、液相色譜-三重四極桿質譜、液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜、液相色譜-四極桿線性離子阱串聯質譜、氣相穩定同位素質譜等，可以對生物大分子、藥物、環境等方面的研究提供技術支撐。作為北京師范大學教師和研究人員開展科學研究的技術支撐體系，質譜中心在開展質譜檢測技術、方法學及在相關領域的應用研究、促進不同學科間的交流合作、培養高水平、高素質專業人才等方面發揮著非常重要的作用。

　　謝孟峽教授還向大家介紹了質譜中心管理委員會成員和學術委員會成員。學術委員會還新聘請了中國科學院生物物理研究所楊福全研究員、清華大學鄧海騰教授、軍事醫學科學院毒物藥物研究所謝劍煒研究員。北京師范大學科技處處長高尚玉教授、生命科學學院何大澄教授和分析測試中心主任李崧主任為新聘任的學術委員會成員頒發了聘書。

向北京師范大學質譜中心新任學術委員會委員頒發聘書合影，由左向右依次為：謝孟峽教授、高尚玉教授、謝劍煒研究員、楊福全研究員、鄧海騰教授、何大澄教授

, 　　質譜論壇學術報告

賽默飛世爾科技色譜質譜部應用工程師劉婷

　　來自賽默飛世爾科技的應用工程師劉婷為大家作了題為《高分辨質譜提高代謝物鑒定的數量和可靠性》的報告。

　　代謝物鑒定的重要性

　　劉工程師講到，DMPK貫穿新藥研發的始終，FDA以及SFDA里面都有藥物DMPK的相關指導原則，即：新藥研發中，為了評價藥物的安全性和有效性，需要闡明藥物的代謝過程，并考察可能的藥物相互作用。

　　2002年MIST法案和2008年的FDA指南都規定了必須要鑒定出主要的代謝產物、活性代謝產物和具有毒性的代謝產物。并且FDA指南規定，在人血液里，在穩態條件下，血液中的代謝產物達到了母藥暴露水平的10%則必須進行定量研究。

　　高分辨質譜提高代謝物鑒定的數量和可靠性

　　從代謝物鑒定方法的發展來看，1989年以前主要是利用TLC和HPLC 來進行鑒定，耗時長，效率不高，鑒定幾種代謝物通常需花費幾周甚至幾個月的時間，且缺乏定性能力；90年代后，LC/MS技術得到應用，主要應用離子阱質譜和三重四極桿質譜，可以較好地定性，將幾個代謝產物鑒定的時間縮短為幾周，但是仍無法滿足藥物代謝研究中高通量的要求；2008年之后，高分辨質譜在藥物代謝研究中的應用越來越廣泛，這類質譜包括Q-TOF、Orbitrap等，在幾天的時間內就能鑒定出1-3個化合物。

　　那么為什么要用高分辨質譜，多少分辨率才夠用呢？藥物代謝研究針對的不是標準品而是復雜的生物基質，存在大量的干擾，高分辨的意義就在于可以有效地排除干擾。在舉例Isazophos（m/z 314.04941）的藥物定量實驗中，存在本底噪音（m/z 314.07141），分辨率只有在50,000以上，才可能很好地排除干擾并準確定量。另一個例子是測定紅茶中的茶多酚，分辨率達到80,000時才足以準確地鑒定花青素（m/z 577.13405）并排除干擾（m/z 577.15518），和進行定量。

　　關于精確質量數的作用，可以發表在Clinbiochem. 2010. 08.018上的文獻來說明，該例中，質量偏差如控制在±5ppm以內，則能消除假陽性，提高靈敏度。穩定的高質量精度可獲得優異的定量RSD重復性，并可準確定性元素組成。而要獲得提取色譜峰非常對稱的峰形，和穩定的高質量精度，常常需要高分辨（比如舉例中需要50,000以上的分辨率）。

　　代謝物研究中對高分辨質譜的要求是：具備高分辨率和高質量精度，從而保證復雜樣品測定的質量精度；同時還需質量精度穩定性好，才能保證每個掃描點的質量精度。賽默飛世爾科技公司的Orbitrap質譜是當今分辨最高的高通量質量分析器，它包括臺式Orbitrap系列（Exactive）和LTQ Orbitrap系列。今年ASMS推出的Q-Exactive，分辨率達到了140,000，采集速度提高了兩倍；而新推出的LTQ Orbitrap Elite，分辨率達到了240,000，采集速度提高了4倍。

Orbitrap Elite 高場軌道阱質譜儀

Q Exactive 臺式FT軌道阱質譜儀

　　高分辨質譜在代謝產物鑒定的應用思路

　　高分辨質譜用于代謝產物鑒定，最主要的兩條應用思路是應用多種數據采集和數據處理方式。數據采集有多種模式，包括DDPT數據依賴性掃描，可自動激發做多級掃描；母藥分子式如含有鹵族元素可用同位素激發模式做數據依賴性掃描；依賴儀器需要運用極性切換的功能來進行代謝物確認。

　　數據分析時用到兩類數據：一類是全掃描數據，一類是多級掃描數據。針對全掃描數據分析，常用方法包括質量虧損過濾（MDF）及多重質量虧損過濾（MMDF）、背景扣除、同位素過濾、提取離子流圖。針對多級掃描數據分析，常用子離子過濾和中性丟失過濾（即根據一些中性丟失碎片進行代謝物查找）。

　　應用實例——雷公藤甲素代謝物鑒定

　　接下來劉工重點列舉了雷公藤甲素（Triptolide）代謝物鑒定的應用實例。雷公藤是臨床上治療風濕性關節炎的主要用藥，毒性很強，臨床表現為肝腎毒性。其中雷公藤甲素是雷公藤的主要藥理成分，研究雷公藤甲素的代謝產物特別是反應性代謝產物對解釋雷公藤的肝腎毒性有重要的意義。其研究難點在于：質譜離子化效果不佳，響應強度不高。

　　該實驗主要運用賽默飛世爾科技Acclea U-HPLC和LTQ Orbitrap與Q-Exactive質譜進行分析，分別進行了雷公藤甲素體外和體內代謝分析。

　　在建立LC-MSⁿ方法中，首先對流動相進行了優化，加入了NH₄AC幫助形成[M+NH₄]⁺從而提高信號響應，解決了靈敏度問題。LTQ Orbitrap和Q-Exactive質譜主要采用了數據依賴性掃描，其中LTQ Orbitrap主要采用的是CID加寬帶激發碰撞模式，Q-Exactive則采用HCD高能碰撞模式，從而得到更多離子碎片信息。

　　Metworks軟件確認代謝物過程實現了數據采集和數據分析兩種功能。Metworks軟件的MMDF（多重質量虧損過濾）功能用于分析體內大鼠尿液樣品，中性丟失過濾功能進行反應性代謝物查找，子離子過濾功能查找代謝物，Mass Frontier軟件對雷公藤甲素碎片分析，最終發現了107種代謝物。

中國科學院生物物理研究所楊福全研究員

　　來自中國科學院生物物理研究所的楊福全研究員的演講題為《蛋白質組學技術在生物醫學研究中的應用》。

　　楊老師首先總結了用于蛋白質組學的定性和定量技術。在蛋白質定性方面的主流技術包括兩條路線：基于雙向電泳和生物質譜的技術路線；基于多維液相色譜-質譜聯用技術路線（美國John Yates教授創建）。蛋白質組的定量當前更受到關注，目前也有幾種技術：（1）基于表面增強激光解吸電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）的差異蛋白篩選技術，應用于臨床生物標志物發現，發現的蛋白分子量小于20,000。（2）基于雙向電泳（2-DE）的差異蛋白質篩選技術，可發現10,000分子量以上的差異蛋白，后來還發展出靈敏度重現性更好的熒光差異電泳（DIGE）方法。（3）目前主流的基于LC-MS/MS的定量蛋白質組學，包括相對定量的穩定同位素標記和無標記定量策略，以及絕對定量的基于多反應監測（MRM）的定量策略。標記策略又分為體外標記（如H₂¹⁸O、ICAT、cICAT、iTRAQ），以及體內標記（如SILAC）。無標記定量可以用比較色譜峰面積、收集所有需進行比較的多肽的譜圖進行統計分析來相對定量，但為獲得更好的重現性，對色譜分離條件和樣品都要求較高。在蛋白質組驗證階段，用Western Blot法定量通量太低，所以現在流行用三重四極桿的MRM進行絕對定量。

　　蛋白質組學在生物醫學研究中的應用包括：蛋白質表達譜分析，疾病相關蛋白質生物標志物的發現和鑒定，蛋白質翻譯后修飾，蛋白質復合物的鑒定、蛋白質-蛋白質相互作用研究，細胞分化、胚胎發育過程中蛋白質表達變化分析分析，蛋白質功能研究（降解機制、構象等）。其中蛋白質表達譜分析用于血漿蛋白質組學、肝臟蛋白質組學、腦蛋白質組學、尿蛋白質組學、腦脊液蛋白質質組學以及亞細胞器蛋白質組學等。

　　接下來楊老師列舉了自己開展過的多個生物醫學相關的研究實例，并總結了一些經驗和教訓，讓每個人都受益匪淺。

基質細胞衍生因子（SDF-1）在血清中降解機制研究中，楊老師用LC-MS的方法和分析化學的經驗成功解決了生物學家碰到的問題，該工作發表在2004和2005年的《Blood》上。該工作的研究目的是：生物體內同時存在SDF-1 α 和SDF-1 β的意義何在？SDF-1不斷在基質細胞、樹枝狀細胞、內皮細胞以及其它細胞中表達，在骨髓中不斷被降解，其作用的酶是什么？合作的生物學家用新鮮的人血清對重組的SDF-1 α 和SDF-1 β進行20小時的孵育處理后，用SDS PAGE分析，發現了分子量變化，希望楊老師能測定和解釋這種變化。但實際上當時生物學家關心的是丟失的那段質量，所以在處理中加了分子量透析步驟，因此開始很難找到質譜信號。在楊老師仔細了解后，建議用LC-MS測定處理后剩余的那段分子量（m/z 7,000~9,000），果然得到了很好的結果。隨后對SDF-1 α 的變化進行了動力學的分析和表征。最后的結果表明：在用新鮮血清處理后，SDF-1 α在C端丟失了K、在N端丟失了KP，而SDF-1 β只在N端丟失KP。動力學分析表明SDF-1 α先在C端丟失K、然后在N端丟失了KP，顯然有兩種起作用的酶。最后鑒定出CD26導致了N端KP丟失，Carboxypeptidase N導致了C端斷裂。

和國內某醫院合作，楊老師課題組對白血病相關的生物標志物進行分離鑒定。醫院首先對健康人和白血病患者的血清進行了SELDI分析比較，找到潛在的標志物（目標蛋白質）。隨后，楊老師建立了一套綜合的方法來分離鑒定目標蛋白質。前處理包括對血清樣品脫鹽、去除高豐度蛋白、HPLC分離然后得到純化的目標蛋白，然后綜合運用MALDI-TOF-MS直接測定分子量、酶解后用LC-MS/MS測定肽段及蛋白質、N端序列測定等方法，最后成功地鑒定了目標蛋白質。

　另一項和醫院的合作是腫瘤死亡預警蛋白質的分離鑒定。初步的臨床觀察顯示：對比不同腫瘤患者血清的SELDI-TOF-MS檢測譜圖，可發現一組與腫瘤患者病情加重和預后密切相關的異常血清蛋白特征峰，其分子量范圍為11.1-11.9kDa，暫命名為死亡預警蛋白，簡稱LGT。中晚期患者血清中LGT與預后的關系：LGT持續（+）2-3個月，死亡率90%以上，LGT持續（-）為零死亡；LGT由（+）轉（-），死亡率10%。LGT疑似（±）死亡率10%。楊老師課題組將這組LGT蛋白進行MALDI-TOF-MS分析，得到了13種蛋白的鑒定結果。

其它的研究還包括：線蟲線粒體蛋白質表達譜分析；大鼠L6肌管細胞磷酸化蛋白質組分析；胰島β細胞線粒體的蛋白質組及其磷酸化信號網絡的構建；SILAC定量蛋白質組學技術應用于L6骨骼肌細胞分化前后蛋白質表達差異分析等等。由于時間有限，沒有更多地展開介紹。但接下來，楊老師回答了現場很多聽眾的熱烈提問。

清華大學鄧海騰教授

　　來自清華大學生命學院的鄧海騰教授做了題為《Application of mass spectrometry beyond Proteomics》的報告，主要內容是關于質譜在代謝組學方面的應用。

　　回顧質譜百年發展歷史，從英國物理學家Joseph John Thomson研制出世界上第一臺質譜儀，到現在復雜的Orbitraps，近一百年來質譜的發展非常迅速，質譜技術的開發也越來越偏重于應用。從質譜在Nobel上的獲獎情況來看（1906年Thomson獲Nobel物理學獎；1922年Aston因同位素模式獲Nobel化學獎；1939年Lawrence因回旋共振獲Nobel物理學獎；1989年Wolfgang Paul因離子阱獲Nobel物理學獎；2002年John Fenn和田中耕一因離子源獲Nobel化學獎），鄧教授認為下一個質譜方面的Nobel獎可能會是傅立葉變換在質譜儀上的應用。傅立葉變換是一個非常重要的工具，通過傅立葉變換可以把時域信號轉化為頻率，通過頻率和質量的關系，我們就能得到高精確度的質譜圖。根據文獻（Mann and Kelleher PANS November 25,2008 vol. 105 No. 47 18135）對比，低分辨離子阱/四極桿/三重四極桿的精確度是1-0.1Da，中等分辨的飛行時間/Q-TOF的精確度為0.1-0.01Da，而高分辨的FTICR MS/FT-Orbitrap這類傅立葉質譜儀的精確度高達0.01-0.001Da。更高的分辨將提高蛋白質組學鑒定的確信度，并能夠檢測多種變化、翻譯后修飾等。

　　鄧教授援引Nature上的一篇提為《2020 visions》的文章，其中提到在以后十年里比較有前途的兩個領域是代謝組學和微生物組學。廣義的代謝組學可分為很多小的領域，如糖的代謝組學、脂質組學等。目前科學家們還建立了代謝組學的數據庫，如Scripps代謝組學中心建立的METLIN數據庫，和Human Metabolome Database。代謝產物檢測的流程并不復雜（比蛋白質組學稍微簡單一些），一般為生物化學萃取－樣品制備－LC-MS(+)或LC-MS(-)/GC-MS－鑒定－定量－解釋，難點集中在最后兩個步驟，要借助一些軟件。

      比較《Sarcosine levels in prostate cancer and its association with cell invasion》(A Sreekumar el al. Nature 457, 910-914, 2009），把癌癥病人分為兩組，一組是癌細胞還未擴散的病人，一組是已經擴散的惡性病人，進行代謝組學分析。鑒定出1000余種小分子，并發現其中有6種小分子表達濃度在癌癥病人（尤其是惡性癌癥病人）中比正常人高很多，比如肌氨酸（sarcosine）。研究者還在細胞中添加了sarcosine，發現會增加細胞的movement擴散度（雖然很多人認為這不是一個非常好的證明方法）。研究者還解釋了這個小分子發生作用的機理，并指出了一種甲基化酶，把一個甲基放在了glysine上，就變成了sarcosine；而有了酶，就有了一個藥物靶向分子。這是一個非常好的例子，通過代謝組學研究，可以發現生物標志物。當然，正如蛋白質組學研究一樣，接下來的幾年尚無法證實發現的這個sarcosine小分子是非常特異的生物標志物。目前也有種觀點倡導系統生物學研究，即認為真正起作用的生物標志物可能是包含小分子、大分子等的一組物質，來協同起作用。

　　接下來，鄧教授介紹了在結核病新藥研發方面的研究，結核病（TB）是一種古老的傳染病，由結核桿菌感染引起，占世界三分之一的人口感染了結核桿菌。多種耐藥性結核病菌、HIV/TB雙重感染、治療時間長、存在潛伏期，這都是目前結核病治療面臨的挑戰。鄧教授分別介紹了他們利用代謝組學研究，來篩選新型結核病藥物。比如發現了三種小分子：OPB、FAD、FMN。然后用質譜法來做代謝組學研究，并解釋了其作用的機理。鄧教授還介紹了一種方法來鑒定所有的藥物相關的代謝物。在該藥物的代謝組學研究中，用質譜做代謝譜（profiling）得到5,000~6,000種小分子，即使送到所有數據庫大部分也得不到結果，但毫無疑問，這其中一定有些分子是和藥物有關的，鄧教授介紹了一種最常用的方法，即改變藥物分子（比如用D取代藥物分子中的H），如果產生的代謝產物中有藥物分子，比較用原來的藥物產生的代謝產物分子和D代藥物產生的代謝產物，會發現有些化合物有分子量的區別，通過這種代謝譜分析（Metabolic Profiling），就可鑒定出所有與藥物有關的代謝物，并且推斷藥物的作用機理。

     只是鑒定所有的代謝產物是不夠的，如果要建立一個所有代謝的代謝途徑，就要進行Flux分析（代謝通量分析）。Flux分析在人身上是做不了的，一般都是在E. Coli（或yeast）上做的。用穩定同位素標記E. Coli，然后進行代謝，在不同的時間提取代謝產物進行色譜-質譜分析，看看代謝產物的變化。比較有影響的一篇文章是《Systems-level metabolic flux profiling identifies fatty acid synthesis as a target for antiviral therapy》(Nature Biotechnology 26, 1179, 2008) ，它對人巨細胞病毒human cytomegalovirus (HCMV)進行了Flux代謝通量分析。用¹³C標記的葡萄糖和谷氨酰胺來喂養哺乳動物細胞并進行動力學監測。感染HCMV的代謝通量通過包括糖解的多數中央碳代謝途徑顯著上調，特別是通過三羧酸循環和其流出到脂肪酸生物合成途徑中顯著地增加。而抑制脂肪酸生物合成的藥理抑制劑抑制了HCMV和A型流感的復制。通過該實驗，不僅了解了代謝產物的變化，而且可鑒定一些新的藥物靶分子。

     除了代謝組學外，還需要考慮如何從組學到基因功能。這里介紹了一些合成的小分子來作為探針（Activity-based Chemical Probes），可以和酶的活性位點反應。利用這些探針，可以檢測到酶到底在什么位置。接下來，介紹了Cravatt去年發表在Cell上的文章《Monoacylglycerol lipase regulates a fatty acid network that promotes cancer pathogenesis》(Cell. 140, 49-61. 2010)。

     談到生物醫學中質譜將來的作用，鄧教授談了幾點。由于質譜具有高特異性，目前更有很多高分辨率的質譜，所以對“其它技術可能取代質譜”的擔憂是不必要的。而且相對于結構生物學和單分子分析，質譜的優點還在于可以分析混合物。談到未來的質譜發展，鄧教授認為，十年前我們認為我們可以做蛋白質組，現在的結論是我們只能做一部分蛋白質組，所以和基因組/基因測序的差距還很大。未來十年二十年，希望能出現一種全新的質譜，可以像基因測序儀那樣應用。

軍事醫學科學院謝劍煒研究員

　　來自軍事醫學科學院的謝劍煒研究員做了題為《芥子氣暴露的確證》的報告。首先謝研究員介紹了芥子氣暴露的確證研究的背景。

　　芥子氣（HD）是一種糜爛性化學毒劑，曾多次應用于戰爭中，造成大量人員傷亡，二戰期間侵華日軍就曾經在中國各地遺棄可大量化學武器，對周邊地區人民構成了巨大威脅。芥子氣具有復雜的生物學作用機制，可與人體內的核酸、蛋白質、酶作用，使得細胞的代謝和功能發生障礙，導致變性、炎癥和壞死。因此芥子氣暴露確證技術的研究非常重要。

　　芥子氣是一種雙功能烴化劑，在生理條件下極容易發生親電反應。目前，對于芥子氣暴露確證技術的研究的難點主要集中在以下幾點：

　　（1）毒理機制尚不十分明確；（2）暴露后有潛伏期，不能及時診斷；（3）癥狀與燒傷、化學傷類似；（4）靶器官廣泛，無特效解毒藥。

　　生物標志物是生物體內污染物暴露劑量和生物效應的指示劑。在毒物風險評估、暴露確證、疾病預警、防治效果評價等方面起著重要作用。生物標志物檢測方法的研究是芥子氣中毒或暴露確證的基礎，對芥子氣中毒的臨床快速診斷，中毒程度的評估以及針對性的醫療救治具有重要意義。

　　芥子氣在生物體內的主要代謝途徑包括水解氧化、與蛋白質加合、與DNA加合、以及與谷胱甘肽加合后經β-裂解酶裂解形成一系列的化合物等。芥子氣的生物標志物類型包括：原型、代謝物、DNA/蛋白加合物。生物標志物如果是原型，則迅速反應；如果是代謝物，存在時間也較短（數日）；如果是DNA/蛋白質加合物，可以存在幾周到幾個月的時間，這就更有利于核查員到當地的檢測（比如如何指正幾個月前曾制造過芥子氣的地點）。

　　接下來，謝研究員詳細介紹了他們實驗室在這方面所做的研究。研究思路為：合成純化相關生物標志物參考品（含同位素標記參考品），然后建立溯源性技術方法（色譜-質譜聯用技術，方法遵循FDA生物分析方法認證的要求），再研究染毒動物模型的時量效關系，并從體外實驗，到體內，再到診斷治療。目前，其課題組已經分別建立了芥子氣暴露后的DNA-加合物、蛋白質加合物、水解和代謝產物的高靈敏度、高選擇性質譜分析技術方法：

　　（1）DNA加合物是由具有親電集團的化合物或其體內代謝產物與DNA共價鍵合所形成的化合物，是DNA化學損傷最重要和最普遍的形式。謝研究員課題組通過大鼠的體內外染毒實驗－提取DNA－水解DNA－超高壓液相色譜-三重四極桿離子阱串聯質譜技術，揭示了N7-HETEG、O6-HETEG、Bis-G、N3-HETEA等四種DNA加合物在生物體內的分布及代謝過程，從分子水平研究HD-DNA加合物與暴露劑量、損傷效應之間的聯系，為HD毒理機制的深入研究提供了技術基礎；其中1-21天取血樣和組織樣可檢測DNA加合物N7-HETEG，并可作為生物標志物。

　　（2）采用LC-MS/MS方法，進行HD-蛋白質加合物位點的篩選與評價。芥子氣與血液中豐度較高的蛋白（珠蛋白和HSA）均可發生多位點共價反應。包括球蛋白的17條肽段，HSA的24條肽段以及球蛋白的N-端V殘基、HSA的Q殘基，另外還有16中氨基酸殘基。謝研究員分別介紹了芥子氣與Glu殘基、 Cys殘基、HSA肽段、珠蛋白間的加合反應及其加合位點。然后設計了技術路線：HD和/或HD-d4染毒全血－取紅細胞后提取蛋白－加入珠蛋白后進行Edman降解－SPE萃取后衍生化－通過同位素稀釋-GC-MS（NCI）方法檢測體外染毒(芥子氣暴露)人全血樣中的HETE-Val狀況，并與家兔體外染毒情況進行了比對。結果表明N-HETE-Val可作為芥子氣中毒潛伏期（染毒后15分鐘）以及中毒癥狀消失后（103天）的診斷生物標志物和溯源性檢測生物標志物。

（3）用同位素稀釋-GC-MS檢測尿樣中的TDG和TDGO，并與家兔染毒情況進行了比對。

（4）通過家兔皮膚染毒實驗，發現芥子氣中毒體內谷胱甘肽加合物β-裂解產物的溯源性核查時間長達28天。對于各染毒劑量組，β-裂解產物的排出量均在前 2天的尿樣中較高，3天后排出量就比較少。一周內排出總量的99%以上。結果表明β-裂解產物還原產物SBMTE因其在染毒后一段時間內存在高濃度水平，且體內無內源性物質存在，是確證芥子氣暴露生物標志物之一；1-4天取血漿樣，1-28天取尿樣。

　　實驗室參觀

　　論壇結束后，大家一同乘車前往清華大學，參觀了生物醫學測試中心蛋白化學平臺實驗室。以下是圖文報道：