質譜沙龍第三十二期活動報道

　　2011年7月31日，第三十二期質譜沙龍活動在航天中心醫院成功舉行。來自第二炮兵總醫院、航天中心醫院、AB SCIEX公司、北京艾米諾醫學研究有限公司、華質泰科生物技術（北京）有限公司等近三十位專家、學者、技術工程師等參加了本次沙龍活動，共同探討質譜技術及其在生物醫藥方面的前沿應用。

質譜沙龍活動現場

藥代研究中LC-MS/MS定量方法國內外指導原則的初步解讀

　　航天中心醫院臨床藥理室張丹老師作了題為《藥代研究中LC-MS/MS定量方法國內外指導原則的初步解讀》的報告，介紹了SFDA2005、FDA2001和EMA2010指導原則的適用范圍、涉及方法、方法確證和方法應用等內容。

航天中心醫院臨床藥理室 張丹 老師

　　從三者在適用范圍和涉及方法上的差別來看，SFDA2005主要涉及到臨床實驗，FDA2001和EMA2010涉及到臨床實驗和臨床前，還包括動物的一些樣本分析。方法主要有氣相色譜、液相色譜、氣質聯用、液質聯用，也有串聯質譜等。EMA2010只講到免疫學方法，而SFDA2005和SFDA2001都講到微生物法和免疫學法。下面，張老師將重點解讀指導原則的方法確證和方法應用。

　　方法確證

　　方法確證包括完整方法確證、部分方法確證和交叉方法確證。

　　1、完整方法確證

　　一般對于新的方法、新的化合物和已有方法追加待測物進行同時測定時，都需要進行完整方法確證，其主要涉及到選擇性、基質效應、殘留效應、標準曲線、靈敏度、準確度和精密度、回收率、穩定性和稀釋等九點。

　　選擇性：SFDA中稱為“特異性”，要求分析方法能夠準確、專一地測定分析物，至少要考察6個不同個體的空白生物樣品，目的是證明目標分析物，內源性物質、相應代謝物、降解產物不干擾目標分析物的測定，同時測定的多個分析物不互相干擾；FDA和EMA要求能夠區別和定量生物樣本的內源性物質，以及含有其它的一些成分，要考察6個不同來源的空白生物樣品，并要考察LLOQ，并講了更多的一些干擾物質，如合并用藥、代謝物向母體藥物轉化等。接著，張老師講了3個例子：同時測定兩個代謝物時，這兩個代謝物具有相同的離子對;化合物X葡萄糖醛酸化代謝物的裂解;復方制劑的分組測定，及針對其選擇性所做的工作。

　　基質效應：SFDA要求對于以軟電離質譜為基礎的檢測法(LC-MS、LC-MS-MS)應注意考察分析過程中的介質效應，如離子抑制等；FDA的要求涉及到第8、11和12頁，但沒有說明如何考察；EMA要求在質譜法時要考察這些效應，至少要用6個不同來源，最好能包括溶血的、高血脂的和特殊人群的樣本，考察低濃度水平的，不高于3倍的LLOQ，做法是提取空白基質，分別加入內標，然后根據得出的結果進行計算。

　　殘留效應：殘留效應只有在EMA2010中提到，在一個高濃度樣本后面，緊接走一個BK空白生物樣本，目的是測定高濃度樣本是否有殘留對低濃度樣本造成干擾，接受標準與選擇性類似。影響殘留效用的因素主要有儀器性能、線性范圍和化合物性質等。

　　標準曲線：三個指導原則提到的基質都要求與待測樣品相同生物介質。濃度點設置，SFDA要求6個和空白，FDA要求6～8個和空白，還要有一個零點樣本，EMA要求不少于6個和空白，也要一個零點樣本。定量原則，三個指導原則都要求不得外推。RE也一致，在最低定量限允許有±20%的誤差，其它的濃度點允許±15%的誤差。接受標準，SFDA要求各濃度點相對誤差在接受范圍內時，標準曲線合格，FDA要求≥2/3的濃度點應在接受范圍內，EMA要求≥3/4的濃度點應在接受范圍內。提供數據，三原則的各點濃度偏差、回歸方程和相關系數是一致的，只是FDA和EMA要求不合格的濃度點不納入回歸計算。

　　靈敏度/定量下限：三原則定義都是標準曲線最低濃度點，SFDA和FDA要求每批至少做5個濃度，EMA要求至少要在2天之內連續3個分析批，而且每批都要做5個。SFDA和EMA對信噪比沒有要求，而FDA有5倍響應的要求。接受標準，SFDA要求RSD<20%，FDA要求RSD≤20%，EMA要求平均是20%，內部和之間RSD≤20%，內標IS 的RSD<5%

　　準確度和精密度：要求用3個濃度的質控樣品同時進行方法的精密度和準確度考察。EMA中將LLOQ納入到準確度和精密度，也提到要做3個分析批。SFDA中低濃度選在LLOQ附近，濃度是LLOQ 3倍以內，中濃度是中間選個濃度，高濃度接近ULOQ，FDA與SFDA類似。為獲得批間精密度，三個原則都是在不少于2天內，應至少連續3個分析批合格，而且每批都要做5個。接受標準，SFDA準確度是85～115%（定量下限附近為80%~120%），精密度<15%，EMA要求RE在±15%內，RSD≤15%。

　　回收率：SFDA考察高、中、低3個濃度的提取回收率，其結果應精密并具有可重現性，FDA與之類似，而EMA沒有提到。

　　穩定性：SFDA是根據具體情況，對含藥生物樣品在室溫、冰凍和凍融條件下以及不同存放時間進行穩定性考察；還應注意考察儲備液的穩定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩定性。FDA是要考察凍融穩定性、短期室溫放置穩定性、長期放置穩定性、儲備液的穩定性、以及提取之后的穩定性，應該至少考察兩個濃度水平，樣本量不少于3。EMA與FDA相類似，但是多了實驗臺的考察。

　　稀釋：FDA提到要是濃度超過ULOQ，就要做稀釋方法確證，要闡述稀釋因子準確度和精密度。EMA對此進行了詳細闡述，要是濃度超過ULOQ，一定要進行稀釋方法確證，稀釋因子必須進行闡述，用已知的高于ULOQ濃度的QC，用相應的空白樣本進行稀釋，每一個稀釋因子至少要做5個，誤差要在±15%內，RSD≤15%，稀釋過程要能包含整個應用。

　　2、部分方法確證

　　SFDA沒有提到部分方法驗證。FDA在列出了一些情況下要進行部分情況驗證，如實驗室改變，檢測器改變，抗凝劑改變，基質改變，樣本制備方法改變，濃度范圍改變，儀器或軟件平臺改變，樣本量有限，稀有基質和額外的選擇性考察等。EMA僅在實驗室改變，儀器改變，濃度范圍改變和樣本保存條件改變等，要進行部分方法驗證。總之，應根據原分析測定方法中改變的條件及程度，合理確定部分方法確證的考察內容。

　　3、交叉方法確證

　　SFDA中沒有提到交叉方法驗證的問題，FDA是在實驗室之間比較和不同分析方法比較之間進行交叉方法驗證。EMA只是在實驗室比較用交叉方法驗證。

　　方法應用

　　方法應用就是怎樣去測樣本，它主要涉及到三個方面：分析批的內容，分析批可接受的標準和未知生物樣本的復測。另外，EMA2010新列出一條，即對已經測過的樣本要進行復測，該復測與上面不同，其目的是檢測實驗室方法的整體重現性。

　　確定分析批。SFDA提到每個分析批要有一個標準曲線，隨行測定高、中、低3個濃度的質控樣品，同方法確證；濃度設置也同方法確證，每濃度至少2樣本，且質控樣品數應>未知樣本總數的5%，均勻分布；同一個體的生物樣品，最好在同一批中測定。FDA也要有標準曲線，同方法確證，濃度設置也同方法確證，總數≥6，且≥未知樣本總數的5%，還有系統適應性等問題。EMA標準曲線同方法確確證，濃度設置也同方法確證，至少3個濃度水平，每濃度至少兩樣本，且總數≥未知樣本總數的5%，同一個體的生物樣品最好在同一批中測定。

　　接受標準。SFDA標準曲線的接受標準與其方法確證一樣，EMA也一樣，而FDA要求LLOQ的誤差在20%以內，其它誤差在15%以內，不少于75%的濃度點應在接受范圍內(包括LLOQ、ULOQ)。QC方面，SFDA要求偏差<15%，最多允許1/3的質控樣品結果超限，并且不能出現在同一濃度質控樣品中；FDA、EMA與SFDA相類似。

　　復測。SFDA是每個未知樣品一般測定一次，必要時可進行復測。FDA在法規要求，雙樣本測標不一致，樣本超過定量范圍，樣本萃取過程出現問題，儀器故障，色譜行為不好和不合理數據等情況下要進行復測。EMA在QC不合格，內標的響應有顯著的差異，進樣出問題，高于ULQ，低于LLOQ和有污染等情況下要進行復測。對于FDA和EMA，同時測定多個待測物時，針對結果異常的待測物復測，結果正常的待測物應采用原測定值；樣本復測的理由，最終采納的測定值、采納該值的理由，均應詳細記錄。

　　最后，張老師講了EMA特殊的要求Incurred sample reanalysis，即已經測過的東西，要再重新測定一遍，這不是復測(reassayed samples)，主要目的是為了考察這個方法和實驗室的重現性。介紹了重新測定的原因、測定時間、測定方法和接受標準等。

      在逐條對比中，張老師提出了很多非常細致的問題，大家進行了詳細的討論。

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運用代謝組學尋找疾病生物標志物方法概述

　　第二炮兵總醫院藥學部安卓玲博士作了題為《運用代謝組學尋找疾病生物標志物方法概述》的報告，主要介紹了代謝組學及其應用領域、研究方法和創新點，組合式離子化方式的LC-MS分析方法研究等內容。

第二炮兵總醫院藥學部 安卓玲 博士

　　代謝組學是關于生物體內源性代謝物的整體及其變化規律的科學，根據研究對象和目的不同，生物體系的代謝物分析被分為代謝物靶標分析、代謝輪廓分析、代謝物指紋分析和代謝組學四個層次。代謝組學以疾病、機體平衡和體內小分子代謝物紊亂為研究對象，廣泛應用于藥物研發、病理生理學、中藥、營養學、生命科學和重大疾病研究等領域。

　　代謝組學研究步驟

　　代謝組學研究一般包括樣品采集、樣品前處理、樣品分析、數據輸出、數據處理、結構鑒定和生物學解釋等7個步驟。

　　比較各種樣品前處理方法：

• 液液萃取法適用于組織樣本，可提取目標成分，但是步驟繁瑣。
• 固相萃取法適用于代謝物靶標分析和代謝輪廓分析，能夠增強痕量分析物的檢測能力，提高回收率，并降低樣品對儀器造成的污染，可脫鹽、除去蛋白質等干擾，但是步驟繁瑣，數據量大，數據交叉。
• 有機溶劑沉淀法適用于血液樣本代謝組學研究，能夠除去蛋白質等干擾，但目標成分被蛋白質包裹，造成損失；經驗表明，甲醇沉淀蛋白最好。
• 直接進樣法適用于尿液樣品，不丟失代謝物，最大程度保留樣品信息，但是樣品中的高濃度鹽類成分會造成嚴重的離子化抑制并產生大量的加合離子，還會造成儀器污染，靈敏度下降。

      比較各種樣品分析技術：有核磁、氣相與質譜聯用、液相與質譜聯用和毛細管電泳質譜等。其中，LC-MS適合較高極性和較大分子量的化合物，樣品無需衍生化處理；UPLC/RRLC提高分離能力，縮短樣品的分離時間，降低分析物的檢測限和質譜檢測的離子抑制現象，能夠實現復雜生物樣品的快速高通量分析；親水相互作用色譜(HILIC)適合于強極性和親水性樣品分析，提供互補信息。但是質譜技術最大的缺陷是離子化歧視及檢測的偏向性。

 　 在數據處理之前，要先進行數據的預處理，這些預處理軟件的功能包括：發現峰、識別峰、峰對齊、生成二維矩陣。代謝組學的數據處理軟件，按照軟件授權形式分為商業軟件和開源軟件。數據處理中的模式識別，是化學計量學的重要組成部分，是挖掘數據信息的主要方法。無監督學習方法是不需要有關樣品分類的任何信息，可以從原始譜圖或處理后的信息中對樣本進行歸類，包括主成分分析(PCA)、非線性映射、族類分析等。有監督學習方法是利用多參數模型，對樣品進行識別和分類，由已知分類信息來推測產生樣品間發生分類的因素，包括傳統的顯著性分析(DA)、偏最小二乘法(PLS)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、軟獨立建模分類法(SIMCA)和人工神經網絡(ANN)等。

　　組合式離子化方式的LC-MS分析方法研究（ESI、APCI、APPI）

　　組合式離子化方式的LC-MS分析方法包括離子化能力、適用性和方法學驗證三方面。離子化能力是指對尿液中4個核苷、10個氨基酸、2個雌激素和4個有機酸等代表性代謝物標準品的離子化效率。ESI在體液濃度下難以檢測半胱氨酸、香草酸、雌三醇和雌酮，APPI在體液濃度下難以檢測次黃嘌呤核苷、胞苷、異亮氨酸、纈氨酸、組氨酸、馬尿酸、香草酸和沒食子酸，APCI在體液濃度下難以檢測胞苷、組氨酸和馬尿酸。通過ESI、APCI、APPI離子化方式的RRLC-MS分析方法，檢測22例健康人尿液獲得的代謝物數目，發現共有代謝物和特有代謝物。通過比較不同濃度的20個代表性代謝物標準品提取離子峰的信噪比，“組合式”離子化方法的檢測靈敏度較好，適合于尿液樣品的檢測。對儀器和方法的精密度驗證，各代謝物的提取離子的峰面積的RSD值<20%，符合體液樣品檢測要求。

　　安博士采用組合式離子化方式的LC-MS分析方法，通過質控樣品與混標樣品來監測分析系統的穩定性與儀器的精密度，對19例肺癌患者與22例健康人尿液樣品進行檢測。檢測過程中，分析系統的穩定性較好，儀器的精密性良好，RRLC-MS譜檢測結果可靠。對檢測得到的代謝組學數據進行OPLS-DA分析，獲得了共有及特有的可能生物標志物，并對可能生物標志物的結構予以解析，比較特有可能生物標志物的檢測結果。最后，安博士對可能生物標志物生物學意義作了初步闡釋：氨基酸的含量增高，癌癥患者體內蛋白質代謝紊亂;修飾核苷的含量增高，癌癥患者體內RNA周轉加快，腫瘤細胞中tRNA修飾酶活性增高，造成高度修飾RNA片段；吲哚酚的含量增高，雖未見吲哚酚與癌癥相關的報道，但其與腫瘤發生和癌癥擴散有關。

 

AB SCIEX SelexION?技術——開創質譜選擇性的新紀元

　　AB SCIEX 公司市場部李春波博士作了題為《AB SCIEX SelexION?技術——開創質譜選擇性的新紀元》的報告，主要介紹了SelexION?技術及其應用。

AB SCIEX 公司市場部 李春波 博士

　　生命科學、環境檢測、食品安全等學科應用及面臨的問題，對質譜在選擇性、分辨率、掃描速度、靈敏度等方面不斷提出新的要求，特別是在同分異構體樣品分析和共流出雜質分離分析方面。

　　DMS（差分離子淌度）系統技術特點

　　離子淌度(Ion mobility spectrometry,IMS)，是一種以化合物的氣相離子在電場作用下發生遷移時的淌度來表征該化合物的方法。AB SCIEX在今年的ASMS上推出了具備差分離子淌度分離能力的SelexION? 技術，結合了SelexION? 技術的5500三重四極桿 和QTRAP^? 5500系統，具有一種新維度的選擇性和分析性能，可用于分離同分異構體，消除共流出污染物的影響，降低高的背景噪音，提高數據質量，提高信噪比。離子在DMS中的分離，是通過施加分離電壓，根據離子在高電場和低電場遷移的差異來分離離子。

        市場上有些公司已經采用，比如有一種是把離子淌度裝置放在碰撞室中，這時很多質譜掃描的方式就不能用了，并且這類儀器只能用離子淌度，增加的作用只限于分離某些同分異構體。而AB SCIEX的SelexION裝置，離子淌度放在了離子源之后，Q0之前，即產生的離子通過淌度分離后，還可以在后面的任意一級質譜進行原來的各種質譜采集和掃描方式，具有更高的適用價值，它最后的淌度表示橫軸是CV(V）（可以區分開同分異構體）。另外，由于離子淌度裝置安裝在離子源后，任何用戶可以無需工具、不停真空、2分鐘內拆裝，所以用戶可以方便地選擇：用還是不用離子淌度。在離子源后的這種離子淌度，除了分離同分異構體，還可以降低背景噪音，提高復雜基質中分析物的靈敏度。

       還有一類市場上已經采用的，也是放在離子源后，但它是一種同心環，這種方法做MRM的速度不高，另外拆裝也不是很方便。而SelexION裝置是一個幾毫米的平板，在兩塊平板（10×30mm，1mm間隔）上加RF電壓在平板間形成電場，它進行MRM的速度更快（比環形提高4倍），可以更好地進行多混合物分析和兼容于UHPLC的速度。此外，SelexION裝置非常棒的特點是，它集成了添加化學修飾劑（如異丙醇、甲醇、乙腈等）的功能，可以把離子淌度的分離能力提高10倍，因為化學修飾劑和樣品離子結合，具有動態的成簇（高電場時）/去簇（低電場時）模型，進一步加大了分子之間的差異（如尺寸上的差異）。

　  另外，SelexIon裝置還有一個COV補償電壓，用于校正目標離子的運動軌跡，確保通過DMS到達質量分析器，而基質被有效地去除。SelexIon裝置的調諧穩定性非常好，在超過24小時的固定分離電壓(SV)下，優化的補償電壓(COV)偏移量小于DMS峰寬(半峰高處的峰寬，通常為2.5V)的10%，適用于定量分析和法規實驗室應用。通過血漿樣品1000次重復進樣(66 hours)，結果顯示的重現性和耐用性滿足法規生物分析準則。

AB SCIEX SelexION? 技術

SelexIon裝置圖

DMS如何分離選擇離子

加入化學修飾劑對增大分子差異的作用

分離同分異構體

　　DMS系統應用

　　DMS系統降低了化學背景噪音，廣泛應用于同分異構體的分離，共流出雜質的分析，及對復雜基質中的目標化合物的定量分析。下面，李博士列舉了一些應用實例：麻黃堿/偽麻黃堿，這對手性化合物的分離；Pentoxifylline（血管擴張藥物）的LOQ提高20倍，消除高化學噪音；含有前列腺素F2α(PGF2α)的類花生酸標準品混合物分析，選擇性顯著提高；尿液中鹽酸克倫特羅分析，顯著降低和消除了共流出雜質干擾；對B性腦鈉肽的32個氨基酸分析，顯著降低和消除了共流出雜質干擾；相同分子量化合物的分離等。

　　最后，李博士總結說，AB SCIEX Triple Quad? 5500和QTRAP^? 5500系統的SelexION?技術，開創了選擇性和分析效率的新紀元。降低背景噪音，提高了數據質量和檢測限；對同分異構體，特別是手性化合物具有很好的分離能力；應用化學修飾劑顯著提高了DMS系統的分離能力；卓越的系統穩定性和重現性滿足生物分析確證的需求；提高通量降低對色譜分離和樣品制備的要求。

相關儀器：

SelexION? 差分離子淌度裝置

二炮總醫院 李鵬飛 老師

　　本次沙龍，二炮總醫院李鵬飛老師主持了專題討論，大家圍繞“生物樣本前處理——柱洗脫——色譜柱——分析時間”選擇與取舍，LC-MS/MS應用中問題原因分析和定量指導原則探討等問題進行了熱烈的討論，大家都獲益匪淺。