東曹鼎力支持第13期蛋白質分離純化技術專題研討班

　　2012年5月5日-6日，由中國生物工程雜志社主辦的第13期蛋白質分離純化技術專題研討班在北郵科技大廈如期舉辦。來自科研院所、高校、儀器公司近百名代表與會。作為會議長期贊助商——東曹生物科技有限公司參加了會議，產品經理郝佳越先生還為大家重點介紹了用于蛋白質異構體的HPLC分析的TSK-GEL色譜柱應用。

會議現場

郝佳越先生

　　郝經理首先向大家介紹了公司的相關情況。東曹公司（TOSOH CORPORATION）始建于1935年，本部位于日本東京。東曹（上海）生物科技有限公司負責東曹株式會社生命科學事業部相關產品的銷售及提供關聯的技術服務，主要包括TSKgel色譜柱，Toyopearl填料，GPC儀器，IC儀器及各類醫療診斷產品。

　　TSK-GEL色譜柱的應用

　　蛋白質具有不均一性，隨著抗體藥物、重組蛋白等被廣泛應用于治療，蛋白質差異性的品質管理工作變得極其重要，通過分析研究，從而避免聚合物、變性物質等可能導致的過敏性休克或免疫反應。除蛋白質外，DNA、RNA、多肽類藥物的研發也同樣需要進行此類分析工作。

　　常用的HPLC分析模式 ，有三種：離子交換色譜法 (IEC)、尺寸排阻色譜法 (SEC)、疏水相互作用色譜法 (HIC)。接下來，郝經理通過不同的案例講解了三種模式下的TSK-GEL色譜柱應用研究情況。

　　1、離子交換色譜法 (IEC)

　　TSKgel CM-STAT用于抗體藥物分析實例，如圖：

　　樣品：

　　A； humanized, IgG1

　　B； humanized, IgG1

　　C； chimera, IgG1

　　D； chimera, IgG1

　　E； chimera, IgG1

　　TSKgel CM-STAT用于核糖核酸酶A脫酰胺化的過程跟蹤，下圖：

　　核糖核酸酶A在1%的碳酸銨緩沖液(pH8.2)中溶解配制成5g/L濃度的溶液，然后在37度下孵化0-192個小時。孵化完成后，使用20mmol/L的MES(pH6.0)稀釋至0.25g/L的濃度并進行HPLC分析。核糖核酸酶A及其兩種異構體被完全分離。根據孵化時間與核糖核酸酶A峰面積作圖，并推斷出在1%的碳酸銨緩沖溶液(pH8.2)條件下，核糖核酸酶A的半衰期大約為180個小時。

　　2、尺寸排阻色譜法(SEC)

　　TSKgel G3000SWXL和TSKgel G4000SWXL分別用于免疫球蛋白的分離分析，下圖：

　　樣品：

　　1. Human IgM (from myeloma, M.W.:970kDa)

　　2. Human IgA (colostrum,,M.W.:390kDa)

　　3. Human IgG (M.W.:150kDa)

　　4. Transferrin (M.W.:80kDa)

　　5. Human serum albumin (M.W.:66kDa)

　　TSKgel SuperSW3000 用于抗體二聚體的分析，下圖：

　　樣品：人單克隆抗體(4.6g/L, IgG1)

　　TSKgel G3000SWXL用于木瓜蛋白酶酶解抗體的過程跟蹤，下圖：

　　樣品濃度: 0.19g/L

　　樣品濃度：0.24g/L

　　TSKgel G3000SWXL用于PEG化蛋白的分析，下圖：

　　TSKgel G3000SWXL用于半抗原結合蛋白的分析，下圖：

　　樣品濃度:：DNP-ALP；0.67g/L, anti DNP Fab；1g/L

　　3、疏水相互作用色譜法(HIC)

　　TSKgel Butyl-NPR用于抗體藥物(木瓜蛋白酶酶解產物)的分析，下圖：

脫酰胺化

蛋氨酸氧化

　　TSK-GEL品牌的離子交換色譜柱以及疏水相互作用色譜柱中的固定相，采用了非多孔性、小粒徑的填料，具有極高的分辨率，可以檢測出因為脫酰胺或氧化等過程中產生的1個氨基酸殘基的微小差異。其中尺寸排阻色譜法適合于檢測、分析如多聚體或PEG化蛋白等分子尺寸有較大差異的物質。

　　蛋白質分析用大孔徑C4色譜柱介紹

　　能夠實現蛋白質高分辨率、高回收率分析的反相色譜柱是TSKgel Protein C4-300產品研發理念。它采用了3μm粒徑的硅膠,具有更高的理論塔板數，其中孔徑為30nm，非常適合于蛋白質分離的孔徑尺寸；此外優化了固定相配體的烷基鏈長度以及表面密度，從而抑制了蛋白質的吸附滿足高回收率要求。

　　其規格如下：

　　?基質：硅膠

　　?平均粒徑：3 μm

　　?孔徑：30 nm

　　?比表面積：100 m2/g

　　?表面官能團：C4（丁基）

　　?封端：有（三甲基硅烷）

　　?碳含量：3%

　　?色譜柱尺寸：

　　4.6 mmI.D. ×5 cm, 10 cm, 15 cm

　　 2.0 mmI.D. ×5 cm, 10 cm, 15 cm

　　?保護柱：

　　3.2 mmI.D. ×1.5 cm

　　2.0 mmI.D. ×1 cm

　　“TSKgel Protein C4-300”是一款適合于蛋白分析的反相色譜柱。 通過實驗對比證明，使用短柱可以在高流速下實現快速分析；測定時溫度越高，分辨率也越高。作為蛋白分析中使用的離子對試劑，0.05%的TFA或5mmol/L的高氯酸對于該柱是合適的。