開發驗證與質量管理關注質譜技術臨床應用

　　分析測試百科網訊 2018年4月25日-27日，由復旦大學附屬中山醫院檢驗科主辦、國家級I類繼續教育學習班——“液相色譜-質譜技術臨床應用培訓班”在復旦大學附屬中山醫院獨山廳舉辦。本次活動圍繞LC-MS/MS技術在我國臨床檢驗領域的應用，邀請了國內外著名專家教授，向學員們講授了液相色譜-質譜檢測技術的基本理論、平臺建設、研發與驗證、質量管理、臨床應用、常用檢測項目和相關解決方案等方面的知識，共吸引140多位來自國內各大醫院的檢驗技術人員和相關單位的工作人員參加。

液相色譜-質譜技術臨床應用培訓班現場

　　26日上午的培訓主題是“液相色譜-質譜檢測方法的研發與驗證”，由復旦大學附屬中山醫院檢驗科副主任郭瑋教授主持，杭州凱萊譜精準醫療檢測公司CEO劉華芬博士、復旦大學附屬中山醫院檢驗科質譜團隊陳方俊和美國賓夕法尼亞州立大學Hershey醫學中心實驗室負責人朱玉勝教授分別為學員帶來精彩的培訓報告。

杭州凱萊譜精準醫療檢測公司CEO 劉華芬博士

　　杭州凱萊譜精準醫療檢測公司CEO劉華芬博士的報告題目是《液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）實驗方法開發》。高端臨床醫學檢驗儀器發展包括生化分析方法，免疫分析方法，化學發光分析方法（免疫法）和精準檢測（基因測序+質譜）。精準檢測不存在抗原抗體交叉反應，不易有假陽性；一次進樣，檢測多種指標，節約大量血清；監測代謝通路中多個指標，進行疾病的精準診斷；開放平臺可按需自建LDT。

　　實驗室常見質譜種類包括LC-MS/MS液相色譜-串聯質譜（小分子定量分析），GC-MS氣相色譜-串聯質譜（揮發性化合物檢測、尿液有機酸分析），QTOF MS/Orbit飛行時間/軌道離子阱分析器（多肽、蛋白質、未知物鑒定），MALDI-TOF MS基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（多肽、蛋白、寡核苷酸檢測、微生物鑒定、SNP基因檢測）和ICP-MS電感耦合等離子體質譜（元素分析）。

　　LC-MSMS在臨床應用中具有特異性高，選擇性好，適合復雜基質和有干擾檢測項目；靈敏度高適合體內含量低的物質；可用于多組分分析，如藥物篩查和新生兒篩查等；靈活性高，可根據需求開展LDT項目；方法開發省時省力，可降低大批量檢測成本；內源性小分子標志物的金標準。

復旦大學附屬中山醫院檢驗科質譜團隊 陳方俊

　　復旦大學附屬中山醫院檢驗科質譜團隊陳方俊帶來題為《樣本前處理技術在臨床LC-MS檢測中的應用》的精彩報告，介紹了常見的樣本前處理方法，包括蛋白沉底啊煩，液液萃取法和固相萃取法，稀釋后進樣（DIL），磷脂去除（PLR）和支撐液液萃取等。

　　樣本前處理可以使樣本的基質從復雜基質（血液、血漿、尿液）轉化為更簡單的基質，防止色譜柱的堵塞和MS的損壞；提升質譜檢測的終濃度，從而提高檢測的靈敏度；使樣本進樣基質同流動相初始比例相互匹配。

　　如何科學選擇前處理方法？第一考慮待測物的分子本質，待測分子在不同有機相中的分配系數（是否使用液液萃取）、酸堿程度（SPE填料的選擇）、和同蛋白結合情況都將決定使用的前處理方法（蛋白沉淀或超濾）。第二要考慮打到LLOQ所需的濃縮和稀釋，治療藥物監測一般不需要濃縮，而內源性激素一般需要濃縮。第三要根據實際情況進行調整，例如質譜的靈敏度、方法的資金預算、樣本通量是否過大而需要容易規模化自動化的前處理方法等。

美國賓夕法尼亞州立大學Hershey醫學中心實驗室負責人 朱玉勝教授

　　美國賓夕法尼亞州立大學Hershey醫學中心實驗室負責人朱玉勝教授帶來的報告題目是《LC-MS/MS檢測方法開發與驗證的基本要求》，介紹了LC-MS/MS的相關指南，方法開發的基本步驟和方法驗證的參數等。

　　現行的相關指南中，C62-A指南旨在減少實驗室間臨床LC-MS/MS檢測方法開發與驗證的差異，提出了LS-MS/MS檢測方法開發與驗證的標準方案。C62-A指南的內容包括LC-MS儀器的重要特性，影響檢測方法性能與效用的檢測前因素，方法校準，方法開發過程中重要的分析變量，方法驗證，質量評價與質量控制，臨床檢測項目開展后的監控等。

　　色譜方法的開發可以沿襲既往方法，根據分析物在特定PH條件下的親和性選擇色譜柱，選擇流動相緩沖體系，選擇等度vs梯度分離、優化流速，選擇添加劑等。

　　下午的培訓主題包括“液相色譜-質譜檢測的質量管理”和“液相色譜-質譜臨床應用”，分別由克利夫蘭醫療中心臨床生化主任及醫學總監、美國臨床化學學會（AACC）轉化醫學部門主席、臨床化學鑒定委員會（ComACC）主席王思合教授，MSACL委員會成員、不列顛哥倫比亞大學檢驗科主任、維多利亞大學醫學部客座教授Michael CHen博士，復旦大學附屬中山醫院檢驗科郭瑋教授，廣州金域臨床質譜檢測中心主任、廣州醫科大學金域檢驗學院程雅婷教授，上海交通大學醫學院附屬新華醫院韓連書教授帶來精彩的培訓報告。

克利夫蘭醫療中心臨床生化主任及醫學總監、美國臨床化學學會（AACC）轉化醫學部門主席，臨床化學鑒定委員會（ComACC）主席 王思合教授

　　克利夫蘭醫療中心臨床生化主任及醫學總監、美國臨床化學學會（AACC）轉化醫學部門主席，臨床化學鑒定委員會（ComACC）主席王思合教授帶來的報告題目是《臨床LC-MS實驗室的質量管理》，介紹了臨床實驗室中相關的CLIA’88和CLSI指南，LC-MS檢測方法中的FDA指南、CLSI指南和經驗等。CLIA條例對以診斷、預防或疾病治療、健康評估為目的的人血、體液及組織樣品實驗室檢測確立相應質量標準。

　　好的檢測質量始于方法開發，要滿足臨床需求而非追求檢測卓越性，例如25-羥基維生素D；力求簡約，包括樣本制備、色譜條件和質譜條件；盡量穩健，不依賴于使用者與時間、靈敏度留有緩沖余地。通過驗證是確保質量的重要步驟，全面評估方法，尋找日常操作中可能出現的潛在問題，在項目開展前把問題解決，確保性能持續性，避免非必需干預。

　　臨床實驗室必須參與替代能力測試，以確保可觀的質量評估，必須審查和評價能力測試結果，所有的能力測試及驗證活動必須形成文件。當發現分析質量問題是應努力找出根源，日常操作人員應向方法開發團隊尋求幫助以進一步排除故障，也可聯系廠商工程師進行故障深度排除。如果實驗室使用不同方法或儀器進行同一檢測或在多個檢測地點進行同一檢測，實驗室必須建立對使用不同方法、儀器或檢測地點的檢測結果間關聯每年進行兩次評估確認。

　　LC-MS方法在檢驗醫學中十分重要，質量管理對確保患者診療相關檢測結果報告的質量而言至關重要，質量管理需包括管理人員、方法開發人員、操作人員和故障排除人員在內的團隊一同協力。

MSACL委員會成員、不列顛哥倫比亞大學檢驗科主任、維多利亞大學醫學部客座教授 Michael CHen博士

　　MSACL委員會成員、不列顛哥倫比亞大學檢驗科主任、維多利亞大學醫學部客座教授Michael CHen博士的報告題目是《LC-MS/MS在臨床毒理學中的應用及質量管理》。

　　法醫毒理學是一門主要應用毒理學的理論和技術，研究與法律有關的自殺、他殺和意外或災害事故引起中毒的學科，工作流程與質量要滿足嚴格的監管鏈。臨床毒理學藥物測試主要類別包括應急毒理學、疼痛或成癮管理、治療藥物監測、新生兒藥物檢測和遺傳藥理學，其檢測方法包括免疫試驗（酶聯免疫吸附試驗、酶復合免疫測定技術、克隆酶供體免疫試驗、非儀器化免疫測定裝置）和分析化學方法（GC-MS、LC-MS）等。

　　GC-MS氣質聯用技術因其對微量化合物的檢測上顯示出的可重復性、高選擇性和靈敏度而被廣泛接受。氣質聯用技術在藥物監測領域已有幾十年的應用歷史，還將繼續成為毒理實驗室藥物確認分析的明確標準。電子離子化全掃描模式是藥物和代謝產物全篩查及系統獨立分析的金標方法。LC-MS/MS液相色譜串聯質譜具有高靈敏度和高選擇性的優點，樣品準備要求低，可以更好區分共洗脫化合物，可檢測非揮發性以及熱不穩定化合物，是毒理測試的新金標。與免疫分析相比，質譜技術更為優越，在臨床毒理學已成為金標方法，但免疫分析（POCT）仍然用途廣泛。在臨床毒理學上，LC-MS/MS的方法開發以及質量控制已很完善，各大實驗室都應使用LC-MS/MS做化合物確認。

復旦大學附屬中山醫院檢驗科 郭瑋教授

　　復旦大學附屬中山醫院檢驗科郭瑋教授帶來題為《LC-MS/MS在臨床激素檢測中的應用》的精彩報告，從LC-MS/MS的技術，為什么應用LC-MS/MS檢測激素和如何規范開展LC-MS/MS技術三個方向展開。

　　通過雌二醇檢測、睪酮檢測、類固醇檢測等實際分析結果顯示，采用質譜技術的臨床激素檢測有檢測靈敏度高且低值結果穩定，預處理去蛋白，特異性高，方法開發交易實現以及多物質可同時檢測等特點。

　　規范開展LC-MS/MS技術包括LC-MS臨床檢測的基本要求（實驗室基本要求，儀器設備，分析前準備和質量控制）以及LC-MS檢測方法的建立、驗證與執行。

　　報告指出，LC-MS/MS在臨床激素檢測中具有高靈敏度、高特異性、高通量的有點，一針進樣可檢測多種類類固醇激素，LC-MS/MS檢測趨于自動化和操作標準化，LC-MS/MS要規范管理和良性開展。

廣州金域臨床質譜檢測中心主任、廣州醫科大學金域檢驗學院 程雅婷教授

　　廣州金域臨床質譜檢測中心主任、廣州醫科大學金域檢驗學院程雅婷教授帶來的報告題目是《串聯質譜檢測遺傳代謝病的方法驗證與質量控制》，介紹了質譜技術在遺傳代謝病檢測中的應用，串聯質譜檢測氨基酸、有機酸及脂肪酸氧化代謝病，串聯質譜檢測先天性腎上腺皮質增生癥和串聯質譜檢測遺傳代謝病的質量控制。

　　遺傳代謝病又稱為先天性代謝異常（IMD），是指有異常生化代謝標志物的一大類疾病，其分類包括氨基酸代謝異常，碳水化合物代謝異常，脂肪酸氧化障礙，尿素循環障礙，有機酸代謝異常，核酸代謝異常，金屬元素代謝異常，內分泌代謝異常和骨代謝病等。

　　程雅婷副教授在報告中介紹了串聯質譜技術檢測干血斑中氨基酸、酰基肉堿的檢測流程、方法建立和方法驗證參數以及先天性腎上腺皮質增生癥的發病機制、檢測現狀等。

　　串聯質譜檢測遺傳代謝病的質量控制包括方法學控制，室內質量控制，室間質評，儀器使用與管理，前處理操作規范化，方法學性能評估，臨床溝通及報告解讀等。

上海交通大學醫學院附屬新華醫院 韓連書教授

　　上海交通大學醫學院附屬新華醫院韓連書教授的報告題目是《血串聯質譜檢測結果解讀及應用》，介紹了遺傳代謝病，串聯質譜篩查結果解讀原則，串聯質譜氨基酸檢測結果解讀，串聯質譜酰基肉堿檢測結果解讀，串聯質譜篩查疾病確診原則。

　　遺傳代謝病是基因突變導致維持機體正常代謝所需的某些酶、受體或載體等功能降低或缺乏，導致機體內某些代謝物的正常代謝途徑受阻，代謝底物增加，產物減少引起的疾病。遺傳代謝病多為單基因遺傳病，大部分屬于常染色體隱性遺傳病。

　　遺傳代謝病檢測常用技術包括串聯質譜技術，氣相色譜質譜技術，基因突變檢測，基因芯片檢測，二代測序技術，酶活性檢測，染色體檢測。

　　串聯質譜篩查結果需要結合質控品結果、內標離子強度、胎齡、出生體重進行分析；結果顯著異常即可確診；部分疾病需要MSMS級GCMS聯合診斷，如MMA、PA、MCD、OTCD、酪氨酸血癥等；結果輕度異常可結合基因檢測及其他實驗室檢查綜合分析；臨床患者需要結合臨床表現。