CRISPR／Cas9成功抑制艾滋病病毒HIV1的多個感染步驟

　　近日，中國醫學科學院/北京協和醫學院病原生物學研究所郭斐課題組在基因治療領域著名期刊 Human Gene Therapy 雜志發表題為：CRISPR/Cas9 inhibits multiple steps of HIV‐1 infection的研究論文，使用CRISPR/Cas9技術成功抑制艾滋病病毒HIV-1的多個感染步驟。進一步探討了CRISPR / Cas9抑制HIV-1感染的分子機制，并發現Cas9不僅在病毒DNA中導致插入缺失，而且降低了晚期病毒DNA產物和整合病毒DNA的水平。 數據還表明Cas9僅存在于細胞質中時能夠編輯新合成的HIV-1 DNA并抑制病毒感染。

　　關于CRISPR/Cas9系統的詳細介紹請點擊：CRISPR/Cas9：基因編輯的歷史與發展。

　　使用基因組編輯來抑制HIV-1主要有兩種策略。一種是使用CRISPR/Cas9編輯HIV-1共同受體CCR5，CXCR4或HIV-1復制所必需的其他細胞因子，從而保護基因修飾的原代CD4 + T細胞免受HIV-1感染。

　　另一種是，使用CRISPR/Cas9靶向病毒長末端重復（LTR）啟動子DNA或病毒生存必須基因，從而滅活HIV-1病毒。

　　CRISPR/Cas9提供了一種新穎而強大的治療工具，許多研究人員已經探索了這一工具可以在細胞和小鼠模型中成功抑制HIV-1感染。但這些研究大多是檢測了Cas9對整合到宿主細胞基因組的HIV-1的的編輯效果。并不清楚Cas9在多大程度上影響細胞質中新合成的HIV-1 DNA。

　　在這項研究中，作者使用CRISPR/Cas9基因編輯系統，通過靶向病毒長末端重復序列和基因編碼序列來抑制HIV-1感染。我們觀察到Cas9/gRNA對HIV-1感染的強烈抑制作用，其不僅由于由于Cas9切割而導致病毒DNA的插入和缺失，還源于晚期病毒DNA和整合病毒DNA的顯著降低。后者可能反映了Cas9切割后尚未立即修復的病毒DNA的降解。進一步觀察發現，當Cas9完全位于細胞質中時，它與位于細胞核的Cas9一樣強烈地抑制HIV-1，只是細胞質Cas9無法作用于整合的HIV-1 DNA，因此不能用于消除潛伏期病毒。

　　總之，研究結果表明Cas9/gRNA能夠靶向和編輯細胞質和細胞核中的HIV-1 DNA。Cas9對HIV-1的抑制作用歸因于病毒DNA的插入和缺失以及病毒DNA水平的降低。

　　作者使用了張鋒共享到Addgene的Cas9質粒：px330，質粒圖譜如下：

　　1、通過Cas9 / gRNA抑制HIV-1復制

　　首先設計了靶向HIV-1的LTR、gag、pol、tat和rev區的sgRNA（下圖左），實驗結果表明靶向LTR和tat基因的sgRNA比其他實驗組的sgRNA更強烈地抑制HIV-1感染（下圖右）。

　　2、Cas9 / gRNA抑制HIV-1的產物

　　在存在Cas9/gRNA的情況下，HIV-1病毒的各種蛋白產物大大降低，這些結果進一步證實CRISPR / Cas9能夠通過突變病毒DNA來抑制HIV-1感染。

　　3、CRISPR / Cas9抑制HIV-1逆轉錄和整合

　　HIV-1感染后，病毒核進入細胞，逆轉錄形成線性病毒DNA，并將病毒DNA整合到細胞染色體中。 除了導致病毒DNA的插入和缺失來滅活HIV-1外，CRISPR / Cas9還可能在HIV-1感染期間減少其DNA的水平，因為Cas9切割的HIV-1 DNA如果不立即修復， 會發生降解。 這也是CRISPR / Cas9除了切割HIV-1 DNA之后的NHEJ修復之外導致HIV-1 DNA降低的另一種機制。

　　4、Cas9需要核酸酶活性來抑制HIV-1感染

　　Cas9含有兩個核酸酶結構域HNH和RuvC，它們是Cas9切割兩條DNA鏈所必需的，接下來測試了非切割活性的Cas9-NLS（dCas9-NLS，D10A和H840A）對HIV-1的抑制能力。結果顯示，當與HIV-1特異性gRNA共同作用時，dCas9-NLS不會抑制HIV-1感染，除了gLTR1靶向HIV-1 tat響應性莖環結構（TAR）并適度減少HIV-1感染。這可能是dCas9 / gLTR1與轉錄起始位點結合并阻斷RNA聚合酶啟動轉錄的結果。進一步實驗表明整合病毒的DNA的水平在表達dCas9-NLS / gRNA的細胞中不受影響。這些結果表明核酸酶活性對于Cas9抑制HIV-1感染至關重要。

　　5、CRISPR / Cas9能夠編輯和滅活細胞質中的HIV-1 DNA

　　由于HIV-1逆轉錄發生在細胞質中，因此檢測了沒有NLS的Cas9（Cas9-delNLS）不位于細胞核內，是否也能夠裂解細胞質中新合成的HIV-1 DNA，從而抑制HIV-1感染。

　　注：NLS，核定位序列(Nuclear localization sequence)——蛋白質的一個結構域，通常為一短的氨基酸序列，它能與入核載體相互作用，使蛋白能被運進細胞核。缺失NLS序列的蛋白質無法進入細胞核。

　　免疫熒光成像實驗的結果顯示Cas9 delNLS嚴格位于細胞質中，而不是像Cas9 NLS在細胞質和細胞核中均有分布（下圖）。

　　Cas9-delNLS / gRNA抑制HIV-1基因表達的程度與Cas9-NLS / gRNA類似，此外，rt-PCR結果顯示，Cas9-delNLS / gRNA和Cas9-NLS / gRNA都降低了晚期病毒DNA和整合病毒DNA的水平。 此外，Cas9-delNLS / gRNA將晚期病毒DNA和整合病毒DNA的水平降低至相似水平，表明原病毒DNA的減少是晚期病毒DNA減少的結果。 然而，整合的病毒DNA水平低于由Cas9-NLS / gRNA編輯的晚期病毒DNA的水平。 另外，Cas9-delNLS / gRNA適度降低了早期病毒DNA產物的水平。這些數據表明Cas9-delNLS能夠通過切割和降解細胞質中的HIV-1 DNA來抑制HIV-1感染。

　　注：病毒復制過程中,mRNA可分為：早期,次早期,晚期.主要區別在于轉錄翻譯的蛋白質不同。

　　為了進一步證明Cas9-delNLS僅在細胞質中而不是在細胞核中切割HIV-1DNA，在293LTR-GFP細胞中進行實驗，所述細胞帶有受HIV-1LTR啟動子控制的GFP DNA。 HIV-1 LTR和GFP DNA被整合到細胞DNA中，因此僅存在于細胞核中。當我們用Cas9-delNLS / gRNA或Cas9-NLS / gRNA轉染該LTR-GFP細胞，并通過流式細胞術檢測GFP表達時，發現只有用Cas9NLS / gRNA的顯著減少GFP表達，而不是Cas9-delNLS / gRNA。