NatureBiotechnology連發4篇CRISPR文章,推動該領域跨越式發展

　　 CRISPR已經應用于包含人類，小鼠，酵母，水稻等各個物種中，取得了空前的成功。就在近期，Nature Biotechnology 雜志連續推出了4篇CRISPR技術的進一步升級應用，同時也進一步拓寬了CRISPR技術應用范圍，尤其是為臨床的應用做了非常好的鋪墊。

　　這4篇文章分別是：美國伊利諾伊大學趙惠民研究組的'Genome-scale engineering of Saccharomyces cerevisiae with single-nucleotide precision"研究論文，該論文開發了一種CRISPR-Cas9和同源定向修復（HDR）輔助基因組尺度工程（CHAnGE）方法，該方法可以在酵母中快速產生數以萬計的特定遺傳變異；

　　美國斯坦福大學的“Multiplexed precision genome editing with trackable genomic barcodes in yeast”的研究論文，該論文在酵母開發可追蹤基因組條形碼的多重精確基因組編輯技術，該技術將廣泛用于揭示酵母表型的遺傳基礎；

　　韓國首爾國立大學Kim研究組的“Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy”研究論文，該論文在小鼠胚胎中進行腺嘌呤堿基編輯及糾正杜興氏肌營養不良癥的成年小鼠，這是臨床應用的前奏，具有非常大的應用價值；

　　上海科技大學陳佳研究組及黃行許研究組及上海生科院楊力研究組的“Base editing with a Cpf1–cytidine deaminase fusion”研究論文，該論文開發了一系列基于CRISPR-Cpf1的堿基編輯工具，它們能夠以非常低的indel形式和非C-to-T替換進行有針對性的堿基編輯，并且可以在富含A / T的區域進行編輯。

　　1、美國伊利諾伊大學趙惠民研究組報告了一種CRISPR-Cas9和同源定向修復（HDR）輔助基因組尺度工程（CHAnGE）方法，該方法可以在酵母中快速產生數以萬計的特定遺傳變異。

　　全基因組規模范圍的工程技術能夠通過并行生成全基因組突變來測試多種假設。現有的方法，如MAGE，TRMR和CREATE主要應用于細菌。雖然CREATE被證明在酵母中起作用，但原則上，沒有報道高效，高通量的全基因組工程。一些現有的基因組規模方法的一個問題是，由于大腸桿菌不容易修復雙鏈斷裂，因此在經歷了同源性定向修復的細胞的誘變過程中存在實質性的選擇壓力。在酵母中情況也不一樣，迄今為止，高通量方法還沒有被證明在全基因組范圍內有效地工作。

　　真核生物MAGE（eMAGE）能夠在酵母中進行全基因組規模范圍的工程技術，但eMAGE的編輯效率依賴于靶序列與復制起點的緊密接近以及URA3標記的共同選擇。雖然使用eMAGE進行全基因組規模范圍的工程技術可能是可行的，但沒有證明。美國伊利諾伊大學趙惠民研究組報告了一種CRISPR-Cas9和同源定向修復（HDR）輔助基因組尺度工程（CHAnGE）方法，可以在酵母中快速產生數以萬計的特定遺傳變異。 超過98％的靶序列被有效地編輯，平均頻率為82％。該方法能夠對基因組規模的釀酒酵母進行快速工程化，并進行精確和可跟蹤的編輯。

　　我們對基因型控制表型的理解受限于我們可以精確地改變基因組并且評估每個擾動的表型結果的影響。在這里斯坦福大學研究人員描述了一種基于CRISPR-Cas9的方法，用于在釀酒酵母中使用短的，可跟蹤的，整合的細胞條碼（MAGESTIC）技術，進行多重精確基因組編輯。 MAGESTIC使用陣列合成的寡核苷酸進行基于質粒的高通量編輯，并具有基因組條形碼整合功能，可防止質粒條形碼丟失并實現穩健的表型分型。

　　研究人員證明，通過使用LexA-Fkh1p融合蛋白招募供體DNA至斷裂位點，編輯效率可以提高五倍以上。研究人員對必需基因SEC14進行了飽和度編輯，并鑒定了對脂質信號傳導的化學抑制至關重要的氨基酸。研究人員還構建了數以千計的天然遺傳變異體，其特征在于基因組尺度上的引導錯配耐受性。 MAGESTIC將廣泛用于揭示酵母表型的遺傳基礎。

　　3、韓國首爾國立大學Kim研究組在小鼠胚胎中進行腺嘌呤堿基編輯及糾正杜興氏肌營養不良癥的成年小鼠

　　由工程腺嘌呤脫氨酶和化膿性鏈球菌Cas9 nickase組成的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）以引導RNA（gRNA）依賴性方式，使腺嘌呤  -鳥嘌呤（A-to-G）單核苷酸取代成為可能。 在這里，韓國首爾國立大學Kim研究組展示了這種技術在小鼠胚胎和成年小鼠中的應用。

　　Kim研究組顯示，長的gRNA使腺嘌呤編輯在窗口上游的一個或兩個堿基的位置處，可以用標準的單一向導的RNA（sgRNA）獲得。 Kim研究組通過將ABE mRNA和延伸的gRNA微注射到小鼠胚胎中，在Tyr基因中引入Himalayan點突變，獲得具有白化表型的Tyr突變小鼠。 此外，Kim研究組使用病毒載體將ABE（腺嘌呤堿基編輯器）基因遞送至杜氏肌營養不良癥小鼠模型中的肌細胞，以校正Dmd基因中的無義突變，從而證實了成年動物中堿基編輯的治療潛力。

　　4、上海科技大學陳佳研究組及黃行許研究組及上海生科院楊力研究組合作開發了一系列基于CRISPR-Cpf1的堿基編輯工具，它們能夠以非常低的indel形式和非C-to-T替換進行有針對性的堿基編輯，并且可以在富含A / T的區域進行編輯。、

　　各種物種中，通過將 apolipoprotein B mRNA編輯酶，催化多肽樣（APOBEC）或激活誘導的脫氨酶（AID）胞苷脫氨酶家族成員與CRISPR-Cas系統組合開發的堿基編輯已經用于靶向C對T堿基編輯【1-5】。然而，使用Cas9切口酶（nCas9）作為目前最活躍的BE中脫氨酶融合伴侶增加了不需要的插入和缺失（插入），非C-T堿基置換的頻率，限制編輯富含G / C的PAM序列的區域【6,7】。

　　Cpf1（Cas12a）是另一種Cas蛋白，它與Cas9的不同之處在于：Cpf1需要富含T的PAM序列（TTTV）用于目標DNA的識別【8,9】； Cpf1（CRISPR RNA（crRNA））的sgRNA比Cas9短；并且Cpf1切割位點相對于間隔區DNA中的PAM序列位于遠端和下游，而不是與Cas9的近端和上游【10,11】。與Cas9相比，Cpf1也誘導更少的脫靶（OT）切割基因組【12,13,14】。

　　為了解決以上問題，上海科技大學陳佳研究組及黃行許研究組及上海生科院楊力研究組合作通過將大鼠胞嘧啶脫氨酶APOBEC1融合到無催化活性的Lachnospiraceae細菌Cpf1上，開發了基于CRISPR-Cpf1的堿基編輯工具。 堿基編輯器可識別富含T的PAM序列，并催化人類細胞中的C至T轉換，同時誘導低水平的插入缺失，非C至T替換和脫靶編輯。

　　該研究首次開發了一系列基于CRISPR-Cpf1的堿基編輯工具，它們能夠以非常低的indel形式和非C-to-T替換進行有針對性的基礎編輯，并且可以在富含A / T的區域進行編輯。 未來，預計其他Cpf1酶（例如，識別TTN PAM8的FnCpf1）或工程化的Cpf1 可用于進一步增強dCpf1的堿基編輯作用。