我國學者研制CRISPRCas13a介導的精確定點RNA編輯人工機器

　　 國際學術期刊《Nucleic Acids Research》在線發表了中科院分子植物科學卓越創新中心/植物生理生態研究所李軒研究組合作完成的題為“Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast and its repurposing for precise RNA editing”的研究論文。該工作報導了一個利用新發現CRISPR家族中的Cas13蛋白（VI 型）、及其指導RNA(guide RNA)靶向結合特異序列單鏈RNA的能力，通過設計改造并與人源的RNA脫氨酶催化結構域（hADAR2d）結合，實現了精確定點RNA（A→I）編輯的人工機器。與近年來利用CRISPR家族蛋白（例如Cas9）對DNA編輯來修改基因/調控基因表達不同，Cas13體系不涉及編碼基因DNA的改變，而是通過對基因轉錄產物（mRNA）進行編輯，為改變基因功能和調控表達提供了新的方法和思路。

Figure 1. Implementation of the LshCas13a system in fission yeast

　　近年來利用 CRISPR技術對生物物種基因DNA的編輯（包括切割和堿基替換），獲得了巨大的成功，同時也面臨技術上的限制。與DNA編輯技術互補，一個針對RNA的精確定點編輯技術，有獨特的技術優勢和應用。與DNA編輯技術相比，RNA的定點編輯不改變編碼基因本身（DNA堿基改變后不能逆轉），在時間上、空間上、和效率上更加可控。同時，RNA編輯可以同時修改多個基因、同時靶向多拷貝基因的所有轉錄產物（尤其是對多倍體的物種），所以更加高效。在對疾病的基因治療領域，利用RNA定點編輯修復疾病組織的突變基因，有著重要的應用價值。

　　為了實現精確定點RNA編輯的人工機器，李軒研究組與楊晟研究員、中科院上海巴斯德研究所郝沛研究員、及美國密歇根大學王紅兵教授合作，對新發現CRISPR家族中、具有結合特異序列單鏈RNA能力的Cas13a，首先在模式生物裂殖酵母（S pombe）中實現了其靶向內源RNA和降解靶標RNA的功能。進一步，設計利用Cas13a的改造產物dCas13a（喪失RNA切割活性的突變），將dCas13a與人源的RNA腺嘌呤脫氨酶催化結構域（hADAR2d）融合，引入到裂殖酵母中；再通過設計RNA編輯機器的靶向“零件”-指導RNA，實現了對內源RNA的精確定點編輯。為了對RNA定點編輯機器的設計和參數（編輯堿基位置、距離、指導RNA結構和長度等）進行優化，研究人員構建了一系列不同的設計，并利用一個雙熒光報告（reporter）系統來測試不同設置的編輯效率，從而獲得了精準RNA編輯機器的最優參數。優化后的編輯機器對內源靶標RNA的編輯效率達到了59%。最后，本研究實現的精準RNA編輯機器的功能，進一步體現在對裂殖酵母反轉錄轉座子Tf1突變株的修復和操作的實驗中。Tf1與動物細胞的逆轉錄病毒類似，其跳躍和擴增需要經過中間體RNA的逆轉錄步驟。研究人員利用精準RNA編輯，恢復了Tf1突變株的轉座能力，這個應用對逆轉錄病毒干預和操作提供了一個有潛力的工具。

　　該研究主要由荊新云博士和研究生解冰冉、張牛冰等人完成。相關工作得到了中國農業部項目、國家科技重大專項、和自然科學基金項目的支持。

Figure 2. Construction and validation of the dCas13a-mediated system for site-specific editing ofmRNA for a fluorescent reporter