表觀遺傳學修飾對軸突再生調控作用的研究進展

　　軸突是神經沖動傳遞過程中結構與功能的基本單位。無論在中樞抑或是周圍神經系統損傷后，誘導有效的軸突再生過程是改善神經功能的基礎。現已證實，脊髓損傷后軸突能否再生不僅取決于其固有的生長能力，還取決于軸突所處的環境。神經系統損傷后，神經細胞對軸突再生相關基因的表達動員能力及細胞骨架原料的形成能力是決定軸突固有生長能力的主要內在因素。此外，損傷后病灶微環境內的抑制或促進介質對軸突再生的導向與干預作用作為軸突再生的外因，也同樣扮演著不可忽視的角色。表觀遺傳學修飾系指在保持核苷酸序列穩定的情況下，基因表達狀態發生可遺傳變化的調節方式，包含非編碼RNA、組蛋白共價修飾以及DNA甲基化修飾等。近年來，隨著基因測序及染色質免疫共沉淀等技術的優化與發展，與軸突再生密切相關的表觀修飾靶點被發現，這有望為神經系統損傷的臨床治療提供有力論據。筆者就軸突再生相關的表觀調控機制進行綜述，旨在為本領域研究提供參考。

　　表觀遺傳學修飾對軸突再生相關基因表達的調控作用

　　與神經干/祖細胞等前體階段相比，成熟神經細胞受損后再生能力較差，這一特點在中樞神經系統中尤為明顯。研究發現，對坐骨神經進行預損傷處理（Axt）不僅使軸突再生能力顯著提高，而且使腰叢背根神經節內諸多轉錄因子表達上調，這些轉錄因子的編碼基因序列由此被統稱為再生相關基因（RAGs）。然而，當脊髓等中樞神經系統發生損傷后，神經細胞對RAGs表達的動員能力較弱，這也成為阻礙軸突再生的主要內部因素。因此，促進損傷后RAGs的表達是激活成熟軸突再生能力的關鍵。近年來，microRNA、組蛋白共價修飾以及DNA甲基化等表觀遺傳修飾對神經損傷后RAGs表達的調控作用被逐漸發現，這無疑為損傷后軸突再生研究提供了新靶點。

　　microRNA對軸突再生的調控 microRNA（miR）是重要的表觀遺傳調控機制，其通過識別并結合mRNA的3′端非翻譯區（3′UTR）結構的方式調節蛋白質的轉錄與翻譯過程。在神經系統中，miR的調控范圍涵蓋了神經發育、退變及損傷修復等過程，尤其當神經損傷發生后，神經細胞內miR表達出現劇烈波動。在這里，諸多miR對RAGs表達均具有調控作用。盡管在神經修復的自然病程中，miR的變化對RAGs表達及軸突再生的驅動作用較弱，但miR發揮的表觀修飾作用為軸突再生的上調、下調雙向干預實驗提供了可靠的分子靶點。Zou等發現，RAGs分子1型Smad蛋白（Smad1）在Axt建模后出現表達上調，并使受損神經細胞從轉錄抑制狀態轉化為活化狀態。神經系統中重要的酪氨酸激酶糖原合成酶激酶3β（GSK3β）通過對Smad1的Ser-210位點進行磷酸化的方式使Smad1失活。Jiang等的研究發現，在周圍神經系統中，miR-26a對GSK3β/Smad1信號通路具有調節作用，當神經損傷發生后，miR-26a通過抑制GSK3β的方式使Smad1表達上調，從而促進軸突再生。

　　miR-132與軸突親和力高，沿軸突大量分布。脊髓缺血性損傷發生后，miR-132表達上調。通過調控其下游靶點Rasa1，miR-132可對Ras所轉導的細胞外信號進行干預，從而調控損傷后的軸突再生過程。Hu等通過寡核苷酸與siRNA對DRG內miR-210進行表達干預實驗，發現，miR-210通過對其靶分子Eph受體相互作用蛋白A3（EphrinA3）進行正向調節的方式對損傷后的軸突再生及神經元凋亡進行調控。miRlet-7在神經系統內廣泛分布，抑制DRG內let-7表達可使神經細胞內NGF水平升高，從而促進損傷后軸突再生。

　　此外，在調控軸突再生過程中，miR還能與表觀修飾因子構成調節環路，接受下游分子的反饋調節作用，其中的典型示例就是miR-138/1型Sirtuin蛋白（SIRT1）表觀調節反饋環。SIRT1是NAD依賴型組蛋白去乙酰化酶，miR-138通過調控SIRT1表達的方式抑制軸突再生。但在Axt后，SIRT1表達立即升高，并對神經元內miR-138發揮抑制作用，從而誘導軸突再生。可見，在軸突再生過程中，SIRT1同時扮演著miR-138/SIRT1通路的信號輸入與輸出分子的雙重角色，并參與構成表觀遺傳學反饋環路，從而對軸突再生進行雙向調節。

　　組蛋白共價修飾對軸突再生的調控 組蛋白的共價修飾作用又稱組蛋白密碼，它通過改變組蛋白及各種轉錄元件間的相互作用對特定基因的表達進行精準調控，主要包括乙酰化、甲基化等修飾類型。許多種類的組蛋白共價修飾可通過調控RAGs表達的方式調節軸突再生，這為軸突再生提供了新的調控靶點。組蛋白乙酰化水平的調節由組蛋白乙酰轉移酶（HAT）及組蛋白去乙酰化酶（HDAC）共同完成。HAT將CoA中的活性乙酰基團轉移給組蛋白N端賴氨酸殘基，使其因正電荷增加而具有強疏水性，進而使染色質松散化，以促進轉錄過程。相反，HDAC則發揮轉錄抑制作用。

　　Puttagunta等發現，P300/CBP相關因子（PCAF）具有HAT活性，周圍神經系統進行Axt后PCAF表達量增高，使H3K9乙酰化水平上升并在RAGs（如GAP43、Calanin等）的啟動子區富集，提示PCAF介導的H3K9乙酰化修飾可能對軸突再生具有促進作用；通過外源性PCAF過表達的方式成功誘導軸突在抑制性介質中的再生過程。另有報道指出，過表達P300蛋白能促進卡壓后視神經軸突再生，其機制可能與p53K373及H3K18乙酰化所介導的RAGs的表達上調有關。細胞分化成熟后，較低的組蛋白乙酰化水平有利于維持成熟細胞結構與功能的穩定性，但這通常以犧牲細胞修復能力為代價。Finelli等發現，HDACI與轉錄因子Smad1共同調控周圍神經損傷后細胞內RAG的表達水平。此結果表明，成熟哺乳動物發生神經損傷后，神經細胞軸突有限的再生能力與組蛋白的低乙酰化水平直接相關，維持受損細胞的高乙酰化狀態將有利于軸突再生。

　　與乙酰化修飾類似，組蛋白N端甲基化修飾也是基因表達的重要調控位點。組蛋白H3二價結構域由具有轉錄抑制作用的H3K27me3與激活作用的H3K4me3共同構成，二者對特定基因位點進行偶聯調控。研究發現，在E15大腦皮層神經細胞中，H3K4me3在RAGs啟動子區富集，這種富集現象使組蛋白H3二價結構域重塑，并促進上述RAGs的基因表達。而當神經細胞發育成熟后，上述啟動子區域內的H3K4me3水平發生下調，取而代之的是H3K27me3的大量募集。可見，在成熟神經細胞內H3K27me3的高表達狀態是導致神經損傷后RAGs動員受阻的重要原因。此現象也提示，調節組蛋白H3二價結構域對基因表達調控狀態有望作為激活RAGs表達及軸突再生的有效手段。

　　DNA甲基化對軸突再生的調控 DNA甲基化修飾是指在DNA甲基轉移酶（DNMTs）的催化下，DNA內胞嘧啶選擇性地結合活性甲基基團并形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的生理過程。周圍神經損傷使DRG內DNMT3b表達量顯著提高，提示神經損傷可能影響神經細胞的甲基化狀態。

　　研究發現，脊髓損傷后葉酸結合蛋白的表達量上調，使神經細胞攝取葉酸能力增加；外源性葉酸的攝入不僅使病灶內DNMT3a及3b的表達量升高，而且DNA甲基化水平也隨之增加，并促進損傷后軸突的再生能力。Lindner等發現，建立嚙齒類動物大腦缺血模型后，腦實質內DNMT1表達量立即升高并使DNA甲基化水平升高；而對DNMT1進行敲除，不僅能促進神經細胞突觸形成，而且對缺血組織內神經細胞具有保護作用。盡管同為DNMT家族，但DNMT3與DNMT1卻發揮著截然不同的生物學作用。從功能上看，DNMT3是DNA從頭甲基化作用的關鍵酶，它使原本未發生甲基化的DNA區域被寫入甲基化修飾，而DNMT1的作用則是維持DNA甲基化水平。二者在軸突再生過程中調控靶基因的差異可能是造成上述結果的原因，即DNMT1的失活可能對RAGs的表達具有促進作用。甲基化GpC結合蛋白（MeCP2）能與DNA的CpG島特異性結合，為DNA進行甲基化修飾提供“舞臺”。研究發現，MeCP2突變后調控軸突連接及導向的Sema3F/Nnp2信號通路傳遞受阻，導致神經元的結構和功能異常，表現為神經元體積減小、軸突的萌發及生長障礙。

　　DNA去甲基化酶是擦除DNA甲基化標記的重要手段，它與DNMTs共同維持DNA甲基化水平的動態穩定。轉位蛋白3（TET3）具有雙加氧酶活性，能對DNA中5mC進行逐級氧化，使DNA甲基化水平降低。研究發現，在視神經發育，尤其是軸突生長的過程中，TET3氧化產物5hmC的表達量持續升高，提示DNA的去甲基化狀態利于軸突形成。此外，Axt神經元內TET3表達升高，進而使核內DNA甲基化水平降低，誘導RAGs的表達并促進軸突再生。生長抑制和DNA損傷誘導蛋白45（GADD45）具有DNA去甲基化活性，是誘導DNA損傷后修復的重要蛋白。研究表明，GADD45表達量在周圍神經系統損傷后立即升高，而且神經細胞內，GADD45分布區域與c-Jun等RAGs發生重疊。這提示GADD45介導的去甲基化作用可能對RAGs的表達具有調節作用。

　　表觀遺傳學修飾對軸突再生微環境的調控作用

　　軸突再生過程對其所處的微環境極為敏感。以脊髓損傷（SCI）為例，SCI繼發性損傷使大量神經膠質細胞發生活化，這不僅引發病灶內神經抑制性介質（如Nogo、Omgp及MAG等髓磷脂抑制物）的大量釋放，而且導致了膠質瘢痕的堆積，最后在脊髓內形成軸突再生難以逾越的理化屏障。近年來，組蛋白修飾及miR等表觀調控機制對脊髓損傷后微環境發揮的調節作用被逐漸發現。

　　Shin等發現，抑制HDAC6可抵消CSPG與MAG所具有的軸突抑制作用，從而促進軸突在抑制環境中的再生過程。相反，在多聚賴氨酸等正常介質中，HDAC6失活對軸突生長卻無明顯作用。提示HDAC6對損傷后軸突再生具有調控作用，而對軸突生長則無明顯作用。研究發現，HDACI選擇性抑制劑丙戊酸（VA）不僅能促進SCI后膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）和腦源性神經營養因子（BDNF）表達，而且可以中和髓磷脂抑制因子Nogo-A對軸突再生的抑制作用。miR-133b水平在SCI后的數小時內迅速攀升，并對RhoA表達具有抑制作用，作為髓磷脂抑制信號入胞的效應分子，RhoA的失活導致胞內PI3K/AKT及MEK/ERK通路的傳導受阻，從而促進軸突的再生過程。

　　SCI后髓內的膠質瘢痕在神經損傷后的病理修復過程中扮演著雙重角色，一方面，瘢痕的產生對脊髓炎癥反應具有局限作用，并借此保護脊髓組織的完整性；而另一方面，膠質瘢痕的過度分泌則對軸突再生產生隔離效應，阻礙軸突直接通過病損區域形成神經傳導回路。星形膠質細胞（AS）是SCI繼發損傷后膠質瘢痕的主要來源，SCI后脊髓內AS發生增殖的同時，病灶內miR-145的表達量出現下降；而對AS進行miR-145過表達則可使SCI后AS遷移活化過程受阻，并影響膠質瘢痕的分泌功能。引外，Su等發現，SCI后病灶內AS具備重新編程的能力，通過Sox2轉染可使AS被轉化為雙皮質素（DCX）陽性的神經母細胞，而且這些DCX陽性細胞在VA的體外誘導下出現NeuN陽性及軸突等成熟神經細胞的表型。因此，與徹底抑制SCI繼發損傷及AS活化相比，通過表觀遺傳修飾介導的轉錄后調節精準調控AS的分泌功能更有利于重塑脊髓功能。

　　展望

　　神經損傷發生后，促進軸突再生是重塑神經功能的基礎。盡管近年來針對軸突再生機制進行了大量研究，但誘導有效軸突再生仍難以實現。現已證實，無論是軸突自身再生能力動員方面，還是改善傷后微環境方面，表觀遺傳修飾均發揮著重要的調控作用，這些研究結果為神經損傷的臨床研究提供了可靠的理論依據。隨著化學合成及藥載技術的發展，目前已有多種以表觀調控機制為基礎的脂質體或反義核苷酸類藥物啟動了臨床試驗工作，例如，Santaris公司基于miR-122的反義核苷酸鏈研發的抗HVC藥SPC3649以及Quark和Pfizer聯合研制的以新生血管形成受體RTP801為靶點的反義核苷酸PF-655等，這些藥物的安全性、機體耐受性以及治療效果等已在前期臨床試驗中被充分證實。這無疑預示著miR等表觀修飾靶點在軸突再生方面也同樣擁有著廣闊的應用前景。