冷凍電鏡單粒子法及其應用

冷凍電鏡單粒子法使我們在分子水平對生命過程有了新的認識。核糖體是一個由多種結構相互作用形成的RNA蛋白質復合體，他的結構解析是對這種技術應用的最好說明。從7 0年代Ｆrank開始對核糖體進行單顆粒分析以來 ,二十多年的努力使得大腸桿菌70Ｓ核糖體1.5ｎｍ分辨率的三維結構已經得到揭示。

從這個三維結構模型中我們可以清楚地分辨出各RNA、蛋白組分和它們之間的連接關系。雖然一系列核糖體的三維晶體結構已有報道, 但單顆粒分析對于研究核糖體在蛋白合成過程中的結構變化仍是唯一有效的手段[12]。由于冷凍電鏡可以捕捉到生物分子在不同活性狀態下的瞬時構像，我們可以通過分子的構像改變來了解某個生命活動過程。轉錄的基本過程，mRNA剪接與移位便是成功的例子.核糖體合成蛋白質的整個循環過程中的不同 中間狀態也已通過冷凍電鏡確定。通過這些不同狀態的密度圖，我們可以確定tRNA和延長因子結合的順序過程，同時也可描述核糖體亞基自身的構像變化。這些運動是mRNA轉位和新生肽鏈延長的基礎。

理解生物大分子和大的復合物的反應機制是當今生物學領域里的一項重要目標。而完成這項任務的途徑便是通過鑒定關鍵反應的中間過程并把握其特征。實間分辨（time-resolution）的冷凍電子顯微鏡便是一種方法，可使空間分辨率達1nm左右，時間分辨率達到數毫秒。冷凍電鏡是僅有的從總體上來講適合于在快速時間分辨率上研究大分子及其復合物的構象變化的一種方法。快速冷凍以捕捉反應中間體的可能性許多年以前就已經清楚了，但是只有在引入了噴霧方法以快速混合樣品中的大的和小的分子并形成足夠薄的樣品以利于進行顯微成像之后才變為可行。第二代時間分辨冷凍電鏡儀器使用分檔器和電噴霧技術，運用冷凍電鏡來研究生物大分子及其復合物的瞬時反應的構像。通過在幾毫秒到幾十秒的時間內將反應物快速冷凍以捕捉反應中間過程。將樣品點到電鏡銅網上并在液態乙烷中冷凍后使用計算機控制之后的顯微步驟。為了獲得最大的時間分辨率，在冷凍前可向已覆蓋有一薄層反應物的銅網上噴灑含有另一種反應物的液滴。該過程是在電場作用下進行的電噴霧，每個載網需1-2μl的溶液進行噴霧，產生小于1μm的霧狀液滴。第二種方法是冷凍前先將兩種溶液用攪拌器混勻再點到載網上，這種方法用于反應時間大于1s的反應物。蛋白質反應的結構變化可以在10-15 s內發生，但像結構域的變化幅度較大，在毫秒刻度范圍內發生，通過冷凍電鏡可獲得中等分辨率（~1nm）的解析。也可以通過X-ray和NMR技術獲得原子分辨率的結構解析。

冷凍電鏡獲得的生物大分子復合物的7-9 分辨率的結構信息中包含了單個蛋白質成分或結構域的生物信息，因此能夠指導形成一種完整的復合物的折疊模型。用這種方法已獲得了大稻侏儒病毒6-8 的結構，結合生物信息學提出了其主要衣殼蛋白的折疊模型。