摘要： 細胞計數這是細胞培養中常用的基本技術之一,所用材料為細胞計數板、巴氏吸管和顯微鏡,步驟如下.
一、細胞計數
這是細胞培養中常用的基本技術之一.所用材料為細胞計數板.巴氏吸管和顯微鏡.步驟如下.
取清潔計數板和專用蓋玻片,用絲綢布輕輕擦干.
取細胞懸液0.3ml,加入0.9結晶紫染液,混勻后滴半滴于細胞計數板內,以充滿不外溢為宜.也可直接將細胞懸液在一側滴加到蓋玻片中,不要溢出,也不要過少或出現氣泡.
在顯微鏡下用10X物鏡觀察計數四角大方格中的細胞數.代入下式得出細胞密度.
細胞數（ml）=（4大格細胞數之和/4）×104×稀釋倍數
臺盼藍染色法可計算出活細胞和死細胞數以測定細胞存活百分率.一般0.5%-1.0%的臺盼藍染液可使死細胞染成藍色,活細胞不著色.此外還可用0.02%的藻紅b染液將死細胞或受損細胞染成紅色,或用0.05%的苯胺黑染液將死細胞染成黑絲.
細胞存活率=[4大格活細胞數/（4大格活細胞數+4大格死細胞數）]×100%
在進行細胞計數操作時,必須把細胞懸液準備好,細胞應分散良好,并充分混勻,若出現較多細胞團或細胞數少于200個/10mm2或多于500個/100mm2時,需重制細胞懸液,重新計數.
二、細胞生長曲線和生長倍數
細胞生長曲線是細胞培養實驗中zui基本的指標,是測定細胞絕對增值數值和生長繁殖基本規律常用的簡便方法.常用的方法為：在同一規格的培養瓶中,接種等量的同一代細胞,經培養后每隔24h取出幾瓶細胞進行計數,以培養時間為橫坐標,不同時刻的細胞數的對數為縱坐標,標出各點并連成線,即為該細胞的生長曲線,可反映出細胞生長的動態.
測定生長曲線的另一種方法是用96孔/24孔細胞培養板,分7組,每組3孔,培養1周（7天）,期間逐日檢測一組,計數,zui后把7天中的細胞數值繪成圖,即為細胞生長曲線.
也可采用MTT法來進行生長曲線測定.
標準的細胞生長曲線近似“S”形,一般在傳代后*天細胞數有所減少,經過一段時間的潛伏期,再進入對數生長期,達到平臺期后生長穩定,zui后衰老.
細胞生長倍數是指測定接種時活細胞的濃度,經1個生長周期達到zui大活細胞濃度比例.
生長倍數=培養后zui大活細胞數濃度/接種時的活細胞濃度
三、細胞分裂指數
細胞分裂指數是表示細胞增殖旺盛程度的指標.它以被測的1000個細胞中的分裂細胞數來計算.其方法為：用秋水仙素將細胞處理1-2h后,玩染色制片法制片并染色,計算1000個細胞中分裂象的數目,重復4次取平均值,用百分比表示.
細胞準備.用支持物蓋片培養法.
每24h取出一個小蓋片,按常規方法進行固定,吉姆薩染色或HE染色,封片,制成永久標本.
顯微鏡下選擇細胞密度適中的區域觀察分裂細胞并計數.逐個視野進行,對每一時間組的蓋片各取細胞多、中、少的區域各一個,共計算1000個細胞,計算出平均分裂細胞所占百分比.觀察時要掌握好分裂象標準,主要是確定好劃分間期和前期,末期和間期等的界限,以減少誤差.
細胞分裂指數=分裂細胞數/細胞總數（1000）×1000
四、細胞接種存活率
細胞接種存活率又稱細胞貼壁率.它是下撥被制成分散的懸液后,以低濃度（2-5個/cm2）接種到底物上,貼壁并能存活生長形成細胞小群（克隆）的細胞百分數值,用以表示細胞的生存能力和細胞群的活力.
取對數生長期細胞,用消化法制成細胞懸液,計數后按檢測細胞生長曲線接種細胞的原則,將細胞接種于培養瓶中,接種12-15瓶.
每2h取出一瓶,倒掉培養科,然后加入胰酶消化已貼壁細胞,計數已貼壁細胞,用下面的公式逐個計算每個時間上的貼壁率.每2h一次,共觀察24h即12次.
接種存活率（貼壁率）=（貼壁村活細胞數/接種細胞數）X 100%
五、克隆形成率
細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數,但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆.而形成克隆的細胞必為貼壁和有增值活力的細胞.克隆形成率反映細胞群體依賴性和增值能力兩個重要性狀,由于細胞生物學性狀不同,細胞克隆形成率差別也很大,一般初代培養細胞克隆形成率低,傳代細胞系高；二倍體細胞克隆形成率低,轉化細胞系高；正常細胞克隆形成率低,腫瘤細胞高.并且克隆形成率與接種密度有一定關系,做克隆形成率測定時,接種細胞一定要分散成單細胞懸液,直接接種在皿中,持續1周,隨時檢查,到細胞形成克隆時終止培養.
1、平板克隆形成試驗
取對數生長期的單層培養細胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞,把細胞懸浮在含10%胎牛血清的RPMI培養基中備用.
將細胞懸液做梯度倍數稀釋,以適當的細胞濃度接種于培養皿中.一般按每皿50個、100個、200個細胞的梯度密度接種于含10ml 37℃預溫培養基的皿中,并輕轉動,使細胞分散均勻.置于37℃、5%CO2及飽和濕度的環境下,靜置培養2-3周.
經常觀察,當培養皿中出現肉眼可見的克隆時,終止培養,棄去上清,用PBS小心浸洗2次.加純甲醇或醋酸/甲醇（1：3）5ml,固定15min.然后去固定液,加適量吉姆薩應用染液染10-30min,然后用流水緩慢洗去染液,空氣干燥.
將培養皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片,用肉眼直接計數克隆,或在顯微鏡下計數大于10個細胞的克隆.zui后計算克隆形成率.
克隆形成率=（克隆數/接種細胞）×100%
平板克隆形成試驗方法簡單,適用于貼壁生長的細胞.適宜底物為玻璃的、塑料的瓶.試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度.細胞一定要分散得好,不能有細胞團,接種密度不能過大.
2、軟瓊脂培養克隆形成試驗
取對數生長期細胞,用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打,使之成為單細胞,作活細胞計數,用含20%胎牛血清的DMEM培養基調整細胞密度至1X10^6個/L.然后根據試驗要求做梯度倍數稀釋. 用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低熔點軟瓊脂,高壓滅菌后,維持在40℃中不會凝固.
按1：1比例讓1.2%的瓊脂糖液和2XDMEM培養基混合后,取3ml混合液注入直徑6cm平皿中,冷卻凝固作為底層瓊脂,置CO2恒溫箱中備用.
按1：1比例讓0.7%瓊脂糖液和2XDMEM培養基在無菌試管中相混以后,再向管中加入0.2ml細胞懸液,充分混勻,注入鋪有1.2%瓊脂糖底層的平皿中,逐漸形成雙瓊脂層.待上層瓊脂凝固后,置入37℃、5%CO2恒溫箱中培養10-14天.
把平皿放置在倒置顯微鏡下,觀察細胞克隆數,計算克隆形成率.
軟瓊脂培養法常用來檢測腫瘤細胞系和轉化細胞系.試驗中瓊脂與細胞相混時,瓊脂溫度不宜超過40℃.接種細胞密度每平方厘米不超過35個,一般6cm平皿接種1000個細胞.正常細胞在懸浮狀態下不能增殖,不適用于軟瓊脂克隆形成試驗.