影響酶免ELISA試劑盒操作的因素

一、酶免ELISA試劑盒特異性因素 

1、固相載體的選擇.ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板最為常見.它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近.聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產品的質量差異很大.因此,在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證,評估。

2、包被物的純度.在酶聯免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度.目前由于技術條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性.目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原. 

3、包被抗體的效價.具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。

4、封閉.是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據的空隙,減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。

二、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物 

1、內源性干擾物:類風濕因子（RF）、黃疸等,類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,多數為IgM類,能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應,從而呈現非特異性顯色。

2、外源性干擾物,常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血,被細菌污染,標本凝集不全等.溶血標本,紅細胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色.如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP（辣根過氧化酶）,有國內報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性。

三、操作過程中的問題造成假陽性 

1、加樣 ：對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋,如果加樣不準就會造成誤差,尤其當稀釋倍數大時,很小的絕對誤差,會導致較大的相對誤差,使陰性（或弱陽性）標本呈陽性（或陰性）.加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產生氣泡。

2、洗滌：在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關健一步,應引起操作者重視.無論是手工操作還是機器操作,得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關,ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的.通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。

3、溫育 ：每種試劑都有其最佳反應模式,其中溫度和溫育時間控制是重要因素.因孵育溫度高,反應時間長,會造成整板本底高,陽性率高.溫育一般用濕盒或水浴,反應板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發,板上應加蓋。

4、酶標儀判讀 ：作為記錄測定結果的儀器,酶標儀的性能穩定與否,決定結果的可靠度.首先酶標儀應定期進行保養,對濾光片要定期校正;其次酶標儀波長設置要正確,最好使用雙波長,一個檢測波長,一個參比波長,以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾.此外,在用酶標儀讀數時最好先擦試微孔板底部并壓平板條。

綜上所述,由于酶聯免疫吸附技術目前在技術上缺乏標準化,盡管目前國際上以及我國有了部分標準血清或參比血清（血清盤）.但由于受方法學及技術條件的限制,在酶聯吸附測定中有時不可避免的會出現一定的非特異性,但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至最低限底,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實驗結果。