血凝儀的基本測試原理

目前可開展的血栓/止血成份檢測的主要方法有凝固法、底物顯色法、免疫法、乳膠凝集法等。在表1中可注意到，在血栓/止血檢驗中zui常用的凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）、凝血酶時間（TT）、內源凝血因子、外源凝血因子、高分子量肝素、低分子量肝素、蛋白C、蛋白S等均可用凝固法測量。所以目前半自動血凝儀基本上都是以凝固法測量為主，而在全自動血凝儀中也一定有凝固法測量。

凝固法中又可分為光學法和磁珠法兩類。由于光學法幾乎可涵蓋各種檢測方法，為了降低儀器制造成本，全自動血凝儀以光學法居多。但也有少數高級全自動血凝儀中凝固法測量采用無樣品干擾的雙磁路磁珠法，而其它測量采用光學法，并可同時進行檢測。

一、 凝固法（生物物理法）

凝固法是通過檢測血漿在凝血激活劑作用下的一系列物理量的變化（光、電、機械運動等），由計算機分析所得數據并將之換算成zui終結果，所以也可將其稱作生物物理法。

1. 電流法

電流法利用纖維蛋白原無導電性而纖維蛋白具有導電性的特點，將待測樣品作為電路的一部分，根據凝血過程中電路電流的變化來判斷纖維蛋白的形成。

由于該電流法的不可靠性及單一性，很快被更靈敏、更易擴展的光學法所淘汰。

2. 光學法（比濁法）

光學式血凝儀是根據凝固過程中濁度的變化來測定凝血的。根據不同的光學測量原理，又可分為散射比濁法和透射比濁法兩類。

表1 血栓/止血成份檢測方法

（1）散射比濁法：散射比濁法（圖1）是根據待驗樣品在凝固過程中散射光的變化來確定檢測終點的。在該方法中檢測通道的單色光源與光探測器呈90°直角，當向樣品中加入凝血激活劑后,隨著樣品中纖維蛋白凝塊的形成過程，樣品的散射光強度逐步增加，儀器把這種光學變化描繪成凝固曲線，當樣品完全凝固以后，散射光的強度不再變化。通常是把凝固的起始點作為0%，凝固終點作為100%，把50%作為凝固時間。光探測器接收這一光的變化，將其轉化為電信號，經過放大再被傳送到監測器上進行處理，描出凝固曲線。當測定含有干擾物（高脂血癥、黃疸和溶血）或低纖維蛋白原血癥的特殊樣本時，由于本底濁度的存在，其作為起始點0%的基線會隨之上移或下移，儀器在數據處理過程中用本底扣除的方法來減少了這類標本對測定的影響。但是這是以犧牲有效信號的動態范圍為代價的，對于高濁度標本并不能有效解決問題。

（2）透射比濁法：透射比濁法（圖2）是根據待測樣品在凝固過程中吸光度的變化來確定凝固終點。與散射比濁法不同的是該方法的光路同一般的比色法一樣呈直線安排：來自光源的光線經過處理后變成平行光，透過待測樣品后照射到光電管變成電信號，經過放大后在監測器處理。當向樣品中加入凝血激活劑后，開始的吸光度非常弱，隨著反應管中纖維蛋白凝塊的形成，標本吸光度也逐漸增強，當凝塊完全形成后，吸光度趨于恒定。血凝儀可以自動描記吸光度的變化并繪制曲線，設定其中某一點對應的時間為凝固時間。

就濁度測量原理而言，散射比濁法更為合理、準確。在這類儀器中，光源、樣品、接收器成直角排列，接收器得到的完全是濁度測量所需的散射光。

而在透射比濁法中，光源、樣品、接收器成一直線排列，接收器得到的是很強的透射光和較弱的散射光，前者是有效成份，后者應扣除，所以要進行信號校正，并按經驗公式換算到散射濁度。此法雖儀器簡單，但精度較差。

在上述的設計中都是吸光度從弱變強，而有的產品設計正好相反——吸光度從強變弱。

例如在“光電磁珠法”的設計中，在待測樣本中加入具有一定濁度的試劑和一粒鋼珠，鋼珠在磁場的作用下起攪拌作用，樣本在凝固過程中產生的纖維蛋白絲不斷纏繞于鋼珠上，使液體反而逐漸變清，吸光度值逐漸降低。該方法重復性好，監測范圍大（可以監測結果超高和低纖維蛋白原的各種異常血漿），但是由于仍以監測吸光度變化為依據，所以無法從根本上解決溶血、高脂血癥或乳糜微粒、渾濁等干擾物對檢測的影響。

光學法凝血測試的優點在于靈敏度高、儀器結構簡單、易于自動化，缺點是樣品的光學異常、測試杯的光潔度、加樣中的氣泡等都會成為測量的干擾因素。針對光學法血凝儀遇到有較高初始濁度的樣品就無能為力的弱點，不同型號的光學法血凝儀采取了各種不同的措施。例如，有的用本底扣除的百分濁度法，這對中、低初始濁度有補償作用，而不能解決高濁度樣品的測試；又如，有的利用一階微分的峰值作為凝固終點，但微分處理會引起重復性變差。

3. 雙磁路磁珠法:

早期的是在檢測杯中放一粒磁珠，與杯外一根鐵磁金屬桿緊貼呈直線狀，標本凝固后，由于纖維蛋白的形成，使磁珠移位而偏離金屬桿，儀器據此檢測出凝固終點。這類儀器也可稱為平面磁珠法。早期的平面磁珠法雖能有效克服光學法中樣品本底干擾的問題，但也存在著靈敏度低等問題。

現代磁珠法在八十年代末提出、九十年代初商品化。現代磁珠法曾形象地稱為擺動磁珠法，不過雙磁路磁珠法的名稱更為確切。

雙磁路磁珠法的測試原理（圖3）如下：測試杯兩側的有一組驅動線圈，它們產生恒定的交替電磁場，使測試杯內特制的去磁小鋼珠保持等幅振蕩運動。凝血激活劑加入后，隨著纖維蛋白的產生增多，血漿的粘稠度增加，小鋼珠的運動振幅逐漸減弱，儀器根據另一組測量線圈感應到小鋼珠運動的變化，當運動幅度衰減到50%時確定凝固終點。

雙磁路磁珠法進行凝血測試，完全不受溶血、黃疸及高血脂癥的影響，甚至加樣中產生氣泡也不會影響測試結果。

光學法血凝儀的試劑用量只有手工測量的一半。而磁珠法的試劑用量只有光學法的一半！這是因為在比濁測定過程中，激發光束必須打在測試杯的中間，所以要有足夠的試劑量。在雙磁路磁珠法測量中，鋼珠在測試杯的底部運動，因此試劑只要覆蓋鋼珠運動即可。

雙磁路磁珠法中的測試杯和鋼珠都是ZL技術，有特殊要求。測試杯底部的弧線設計與磁路相關，直接影響測試靈敏度。小鋼珠經過多道工藝特殊處理，完全去掉磁性。在使用過程中，加珠器應遠離磁場，避免鋼珠磁化。為了保證測量的正確性，鋼珠應當一次性使用。

血凝儀的測量過程中，充分攪拌至關重要，這對于凝血過程的描述和凝固終點的判斷都會有很大幫助，CV會有很大改進。在儀器中常用磁珠攪拌或離心方式來達到目的。現在有相當一部分光學式半自動血凝儀采用磁珠攪拌。

二、底物顯色法（生物化學法）

底物顯色法通過測定產色底物的吸光度變化來推測所測物質的含量和活性的，該方法又可稱為生物化學法。檢測通道由一個鹵素燈為檢測光源，波長一般為405nm。探測器與光源呈直線，與比色計相仿。

凝血儀使用產色底物檢測血栓與止血指標的原理是：通過人工合成與天然凝血因子有相似的一段氨基酸排列順序并還有特定作用位點的小肽,并將可水解產色的化學基因與作用位點的氨基酸相連。測定時由于凝血因子具有蛋白不解酶的活性，它不僅作用于天然蛋白質肽鏈，也能作用于人工合成的肽段底物，從而釋放出產色基因，使溶液呈色。產生顏色的深淺與凝血因子活性成比例關系，故可進行精確的定量。目前人工合成的多肽底物有幾十種，而zui常用的是對硝基苯胺（PNA），呈黃色，可用405mm波長進行測定。

底物顯色法靈敏度高、精密度好，而且易于自動化，為血栓/止血檢測開辟了新途徑。

底物顯色法通常使用以下三種形式：

a） 先將被檢血漿中的某種酶加以激活，然后由此活化的凝血因子對人工合成的底物進行水解而呈色，如纖溶酶原，蛋白C測定等。

b） 向被檢血漿中加入過量的有關試劑，以中和相應的抗凝因子，然后測定其殘余的酶活性，如AT-活性測定，α2-抗纖溶酶測定，肝素測定等。

以測定抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）為例，在反應體系中加入過量的凝血酶，后者與血漿中的AT-Ⅲ形成1：1復合物，剩余凝血酶作用于合成的凝血酶底物S-2238（H-D-Phe-Pip-Arg-PNA·2Hcl），釋放出顯色基團PNA，顯色反應的深淺與剩余凝血酶的量呈正相關，而與AT-Ⅲ的活性呈負相關。

c） 直接測定被檢血漿中某種蛋白水解酶的活性，如凝血酶，Xa，尿激酶測定等。

三、免疫學方法

在免疫學方法中以純化的被檢物質為抗原，制備相應的抗體，然后用抗原抗體反應對被檢物進行定性和定量測定。常用方法有:

1．免疫擴散法 將被檢物與相應抗體在一定的介質中結合，測定其沉淀環的大小，與標準進行比較，計算待測物的濃度。此法操作簡單，不需特殊設備，但耗時過長，且靈敏度不高，僅適于含量較高的凝血因子的檢測。

2． 火箭電泳 在一定電場中，凝膠支持物內的被檢測與其相應抗體結合形成的一個個“火箭峰”，火箭峰的高度與其含量成正比，通過測定峰高并與標準比較而進行定量測定。此法操作復雜，臨床應用較少。

3．雙向免疫電泳 通過水平與垂直兩個方向進行電泳可將某些分子結構異常的凝血因子進行分離。

4. 酶聯免疫吸附試驗（ELISA法）用酶標抗原或抗體和被檢物進行抗原結合反應，經過洗滌除去未結合的抗原或抗體及標本中的干擾物質，留下固定在管壁的抗原抗體復合物，然后加入酶的底物和色原性物質，反應產生有色物質，用酶標儀進行測定，顏色的深淺與被檢物濃度呈比例關系。該法靈敏度高，特異強，目前已用于許多止血、血栓成分的檢測。

5．免疫比濁法 將被檢物與其相應抗體混合形成復合物，從而產生足夠大的沉淀顆粒，通過透射比濁或散射比濁進行測定。此法操作簡便，準確性好，便于自動化。

免疫比濁法可分為直接濁度法分析和乳膠比濁法分析。

直接濁度分析既可通過透射比濁，也可通過散射比濁。

透射比濁是指凝血儀光源的光線通過待檢樣本時，由于待檢樣本中的抗原與其對應的抗體反應形成抗原-抗體復合物，使透過的光強度減弱，其減弱程度與抗原量成一定的數量關系，通過這一點可從透過光強度的變化來求得抗原的量。

散射比濁法指凝血儀光源的光通過待測樣本時，由于其中的抗原與特異的抗體形成抗原-抗體復合物，使溶質顆粒增大，光散射增強。散射光強度的變化與抗原的量呈一定的數量關系，通過這一點可從散射光強度的變化來求得抗原含量。

另一種是乳膠比濁法，即將將待檢物質相對應的抗體包被在直徑為15～60nm的乳膠顆粒上，然后與被檢物結合，形成抗原抗體的復合物的乳膠顆粒凝集，體積增大，使透射光和散射光的變化更為顯著，從而提高實驗的靈敏性。用儀器或肉眼進行定量或半定量分析。目前，多用于FDP和D-二聚體的檢測。