多功能酶標儀測定熒光強度

　　HSC-T6、Dulbeceo’s Modafied Eagle’s Medium(DMEM, Sigma);新生小牛血清(杭州四季青公司);Hoechst33258 (Sigma);MTT、JC-1和DMSO(Sigma);次氮基三乙酸鐵(Fe-NTA, Sigma);其余為國產分析純試劑。GS由新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室提供。

　　細胞接種于細胞培養瓶,藥物處理24 h,胰蛋白酶消化,PBS潤洗,液氮反復凍融,以破碎細胞膜。加入新的PBS,在4 ℃、10 000×g下離心15 min。取上清液用PBS稀釋,制成樣品溶液。運用鄰苯酸酚自氧化速率法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性。

　　1.1 試劑及細胞株

【關鍵詞】  甘草總黃酮;石見穿總酚酸;肝星狀細胞;凋亡;線粒體膜電位

　　1.10 熒光探針JC-1測定線粒體膜電位

　　1.9 熒光染料Hoechst33258測定細胞凋亡

　　HSC-T6用含10%小牛血清的DMEM培養基置于37 ℃、5%CO2培養箱培養。傳代后培養8 h即可貼壁生長;2 d后細胞80%～90%鋪滿瓶底,牙周科論文發表,即可再次傳代,傳至3～4代,用于實驗。

　　對數生長期的HSC-T6用含10%新生小牛血清的培養液吹打成單細胞懸液,以每孔5×104個細胞接種到96孔培養板,置于37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h。細胞貼壁率達到70%后藥物處理,繼續培養48 h。最后每孔加MTT溶液20 μL(5 mg/mL),孵育4 h,終止培養,吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μL的二甲基亞砜(DMSO),振蕩10 min,使結晶物充分融解。選擇490 nm波長,多功能酶標儀測定OD值。

　　肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是慢性肝病的共同病理學基礎,其中25%～40%最終發展為肝硬化甚至肝癌 [1]。目前認為,口腔工藝畢業論文,肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)是HF細胞外基質的主要來源細胞,HSC的活化和功能的改變是HF形成的關鍵[2-3],也是抗纖維化研究的核心。越來越多的實驗表明,氧化應激是不同原因引起的HF發生的共同通路。實際上,鐵負載、乙醇、四氯化碳和丙型肝炎病毒等引起HF的病因都可通過氧化應激和脂質過氧化途徑激活HSC。Iredale等[4]的實驗表明,激活的HSC主要不是通過轉化為靜止的HSC實現的,也并非引起壞死,因為纖維間隔及其鄰近區域沒有壞死及炎癥的表現,而是凋亡的結果。在急性或慢性肝損傷修復的動物模型中也發現了HSC的凋亡。由激活的HSC分泌的金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的表達減少,解除了對膠原酶活性的抑制使膠原降解增加,再加上HSC的減少使細胞外基質的分泌減少,兩個原因使細胞外基質降解[4-6]。那么,有針對性地誘導人HSC 發生凋亡為HF的治療提供了實際目標。本課題建立大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)的氧化應激模型,著重研究抗氧化劑甘草總黃酮與石見穿總酚酸聯合用藥(GS)能否促使氧化應激的HSC凋亡,口腔科論文發表,并探討凋亡是否與線粒體凋亡途徑有關。

　　多功能酶標儀(Thermo 3001 VARIOSKAN FLASH);AR-2140型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司制造);CO2培養箱(Forma 3110,USA);蔡司熒光倒置顯微鏡。

　　Key words：Glycyrrhiza uralensis;salvianolic acid;hepatic stellatecells;apoptosis;mitochondria membrane potential

　　對數生長期的HSC-T6經0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的DMEM 培養液調整為單細胞懸液并接種于細胞培養瓶,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。24 h后細胞貼壁良好,換用含0.2%胎牛血清的DMEM培養,使其生長同步化。當細胞貼壁率達到70%后,更換培養液并加入不同濃度的Fe-NTA (0.1、0.5、1 mmol/L)。

　　1.5 氧化應激模型的建立

　　1.2 儀器

　　Fe-NTA處理貼壁良好的HSC-T6 6 h,加GS處理4 h,胰蛋白酶消化,收集細胞到離心管內,PBS潤洗,離心,重復2次。加DCFH-DA至96孔板,終濃度為30 μmol/L,終體積為200 μL,繼續孵育30 min后,PBS潤洗2次,于多功能酶標儀測定熒光強度,激發光為485 nm,發射光為520 nm[7]。

　　1 材料與方法

　　1.6 肝星狀細胞丙二醛含量的測定

　　1.3 細胞培養

　　1.8 細胞內活性氧的測定

【摘要】  目的 研究甘草總黃酮與石見穿總酚酸聯用對氧化應激的肝星狀細胞(HSC)的促凋亡作用。方法 MTT法檢測甘草總黃酮與石見穿總酚酸聯用對大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)增殖的影響。次氮基三乙酸鐵與HSC-T6體外共培養建立氧化應激模型,采用TBA法檢測細胞內丙二醛(MDA)含量,運用鄰苯酸酚自氧化速率法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性。熒光探針DCFH-DA檢測細胞內活性氧水平。熒光染料Hoechst33258觀察細胞的形態及凋亡情況。JC-1檢測細胞內線粒體膜電位變化情況。結果 甘草總黃酮與石見穿總酚酸聯合處理HSC-T6后,細胞的增殖受到抑制,并促進HSC-T6凋亡;細胞內線粒體膜電位下降;隨著藥物劑量的增加細胞內活性氧含量下降。結論 甘草總黃酮與石見穿總酚酸聯用促進氧化應激的HSC凋亡,此作用可能與線粒體凋亡途徑有關。

　　Fe-NTA處理貼壁良好的HSC-T6 6 h,加GS處理4 h,胰蛋白酶消化,收集細胞于離心管內,PBS潤洗2次,加入JC-1,37 ℃避光孵育20 min。PBS潤洗1次,離心,棄上清。PBS重新混懸細胞,移液槍將適量細胞滴于載玻片上,口腔醫學技術論文,蓋上蓋玻片,于熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。

　　細胞發生凋亡時,染色質會固縮,Hoechest33258染色后,在熒光顯微鏡下觀察,正常細胞藍色,而凋亡細胞的細胞核會呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染。染液配成100 μg/mL。臨用時,稀釋為終濃度10 μg/mL。細胞懸液(含3～5×106細胞)1 000×g、40 ℃離心5 min,口腔潰瘍論文。將上清棄去,細胞于30～50 μL 40%(W/V)多聚甲醛中懸浮,細胞涂片干燥,將10 μg/mL Hoechst33258染液滴于載玻片上,避光放置10 min。將玻片侵入蒸餾水中5次進行沖洗,避光干燥。用PBS/甘油粘片,用綠色濾光片在熒光倒置顯微鏡下觀察。

　　細胞接種于細胞培養瓶,藥物處理24 h,胰蛋白酶消化,PBS洗滌,離心,收集細胞。取細胞懸液適量,采用TBA法檢測細胞丙二醛(MDA)含量。

　　1.7 肝星狀細胞內超氧化物歧化酶活性的測定

　Abstract：Objective To investigate the effect of Glycyrrhiza uralensis flavonoids and salvianolic acid (GS) on the apoptosis of HSC-T6 cells. Methods HSC-T6 were incubated with ferric nitrilotriacetic acid (Fe-NTA), SOD activity and MDA content in HSC-T6 were detected. MTT colorimetric method and trypan blue staining were used to measure the cell proliferentiation and survival rate. Production of reactive oxygen species (ROS) of drug-treated cells were monitored by a fluorescent probe 2’,7’-dichlorodihydrofluorescin fluorescence (DCFH-DA). Morphological changes associated with apoptosis were examined by staining with Hoechst33258. Moreover, changes in mitochondrial transmembrane potential were determinde by the dual-emission potential-sensitive probe 5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1). Result Oxidative stress decreased the activity of SOD in HSCs, increased the content of MDA in HSC-T6. GS inhibited the cells proliferation and decreased the iROS levels in a dose dependent manner, After 24 hours treatment with GS, the typical apoptic morphology was found in HSCs, including the decrease of karyoplasmic ratio and the increase of kidney-shape nuclear cells. Furthermore, GS induced a concentration decrease in ROS production and in mitochondrial membrane potential. Conclusion GS play an important role in oxidative stress HSC-T6 apoptosis which may be corrected with mitochondria apoptosis pathway.

　　1.4 MTT法測定細胞活力