納米顆粒跟蹤分析技術在生物醫學中的應用

       納米顆粒跟蹤分析技術（簡稱：NTA），是近年來新興的納米級別測量技術之一，原理如圖1所示。納米顆粒在其懸濁液中受到周邊溶液分子的撞擊而做無規則的布朗運動，然后通過斯托克斯-愛因斯坦方程，這些顆粒在單位時間內 (ts) 的移動速度（2）與其本身的粒度（dh）、溶液的粘度（?）和溫度（T）存在數量上的關系。因此通過觀察溶液中的顆粒運動軌跡，得出與之相關的顆粒粒徑數據。同時，通過儀器內置的高速相機和軟件，對觀察到的每一個顆粒進行跟蹤分析，最終提供與常規粒度儀所不同的粒徑數量分布以及顆粒物濃度的分析結果。

  圖1（左） 納米顆粒受到溶液分子撞擊做無規則的布朗運動        （右）斯托克斯-愛因斯坦方程   

       在光學顯微鏡時代，生物醫學中通常能夠觀察到的顆粒或者目標的大小一般從數微米到數十微米不等，但在納米粒度儀的引入之前，人們就已經意識到未來的研究會趨向更為微觀的視角，外泌體、病毒和噬菌體以及生物制品如抗體和疫苗，這些顆粒的粒度都遠小于光學顯微鏡的觀察范圍；同時，常規生物醫學檢測方法（如：病毒滴度測試，病毒蝕斑測試，Elisa等）往往只能在宏觀上予以相對比較籠統的表達。因此，本文希望通過簡單分享近年來納米顆粒跟蹤分析技術的應用，來進一步了解全新的納米技術是如何在生物醫學領域中起到越來越重要的作用。

NTA在外泌體及病毒和疫苗領域的前瞻應用

       外泌體最早發現于體外培養的綿羊紅細胞上清液中，是細胞主動分泌的大小較為均一，直徑為30~100納米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡樣小體。隨著分子技術的不斷發展，生物學界對外泌體的探索日趨深入。2013年，三位國外科學家因在細胞膜轉運機制的研究上取得關鍵性突破，被授予諾貝爾生理學或醫學獎。由此，外泌體研究達到了一個全新的高度。

而近年來，越來越多證據顯示出外泌體對臨床治療的重要價值。外泌體是細胞間信使，通過其數量和生物化學組成的變化，可以為進一步的臨床診斷提供有力的證據。它攜帶多種蛋白質和miRNA，參與細胞信號轉導、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等過程，并且有可能成為藥物的天然載體，應用于腫瘤檢測或臨床治療。

目前外泌體的檢測與觀察主要通過電子顯微鏡完成，電子顯微鏡通過直接的測量比對，描述外泌體的粒徑尺寸并且能夠清晰的顯示外泌體顆粒的具體結構。當然，這種方法所存在的不足也很明顯。由于一次所能觀察到的范圍有限，因此所獲得的粒徑分布數據往往不具代表性。同時，電子顯微鏡的樣本，往往需要通過干燥、固定以及冷凍等不同方式進行前處理，這對生物樣本的結構會造成一定的破壞，從而最終影響觀察的效果。

相對而言，馬爾文納米顆粒跟蹤分析儀（簡稱：NanoSight）所具備的溶液狀態（原位測試）下的測試，為外泌體顆粒提供了非常好的結構與功能上的保護，并且能夠讓外泌體顆粒在更接近其原始狀態下進行測量，保證了測量數據的真實性和有效性。此外，其高精度的粒度數量分布測試，甚至可以分辨出相對粒徑差異在1：1.5倍左右的顆粒，尤其在生物樣本中，顆粒的分布呈現極度不均勻的寬分布狀態，一些粒徑小數量少的顆粒在分析中容易被常規測量方法所忽略，而馬爾文NanoSight提供的數量分布粒度測試有效地解決了這一問題。另外，獨一無二的濃度測量技術，直接為外泌體研究人員提供可靠的外泌體濃度數據。目前已得到證明，在不同的生理狀態下，外泌體的濃度變化與不同的細胞生長狀態和種類有關。

在傳統病毒學中，病毒溶液中病毒顆粒的濃度一般通過物理法或者生物學法測試。這其中，物理法通過病毒DNA對光的吸收進行測定，結果非常穩定卻無法區分病毒顆粒的種類。生物學方法如GTU、PFU和TCID50等，也存在局限，如測試結果不穩定，不同的操作人員很難能得出相近的結果。

NTA技術通過分析病毒懸濁液中病毒顆粒的布朗運動，使用斯托克斯-愛因斯坦方程，能夠快速準確的檢測出病毒粒度的數量分布。同時，特有的濃度測試系統提供樣本的實時濃度信息。更重要的是，馬爾文NanoSight特有的熒光系統，為分辨病毒顆粒的種類提供了極為方便的平臺，科研人員可根據自己的需求設計不同吸收波長的熒光染色，從而達到分辨不同種類病毒顆粒的目的。目前有四種熒光波長可供使用，分別為405nm、488nm、532nm和635nm，搭配相應的濾光片，實現熒光樣品的測量，再由NTA技術對其進行單獨檢測，免受復雜樣本（如血清、尿液等）環境的影響。

當前，納米顆粒跟蹤分析技術正越來越多的用于生物醫學的基礎以及臨床研究中，同時，在一些生物和藥物制劑的生產和質檢中，我們也越來越多地看到它的身影。當然，NTA技術不僅在科研領域有所應用，而且已經拓展到了許多生物和醫藥制品的生產及質檢等環節中。

眾所周知，在疫苗和抗體的生產、運輸和儲存過程中，由于環境的改變和條件的限制，往往不能夠完全保證產品一直處于最佳的環境。而環境的微妙改變，往往會導致不同程度的小顆粒物團聚。在疫苗和抗體的使用過程中，如果產生的較大顆粒進入人體后，非常容易引起強烈的排異反應，從而可能會產生極為嚴重的后果。

以蛋白質為主體的疫苗和抗體顆粒，在pH值、溫度、溶液成分發生變化時，蛋白質顆粒容易發生結構和表面電位等不同方面的變化，從而導致顆粒之間相互團聚。馬爾文NanoSight提供了一個非常全面的測試平臺，用戶在使用中有充分的自由度來模擬不同情況。由于該平臺可同時進樣和測試，因此在調整顆粒溶液的測試環境后，用戶可以迅速的得到新條件下樣本的變化數據。

一般情況下，影響蛋白質產品的最主要環境因素可能是溫度。在持續的高溫下，蛋白質會產生變性、團聚。為了了解溫度對免疫球蛋白IgG的影響，借助馬爾文NanoSight的自動溫度控制平（平臺可控溫度為18-55℃

) ，研究人員做了如下測試：將IgG溶液保存在在55℃的恒溫狀態下，在5mins、15min、20mins、30mins、60mins、120mins、3hrs、4hrs和5hrs分別進行數據和視頻的采集。通過比對和數據分析，研究人員發現在55℃的環境溫度下，IgG在30分鐘左右開始出現明顯的聚集現象（具體參考圖2）。這也為生產疫苗和抗體的廠家提供了可信的實際數據，從而推斷產品在不同狀況下的保存時間和要求，預防產品的變質和不正確使用，保障使用過程的高效和安全。

圖2 樣本溫度在55℃的狀態下，分別在5mins、15min、20mins、30mins、60mins、120mins、3hrs、4hrs和5hrs采集的視頻清楚的呈現了抗體的團聚過程

更多新功能開發，全方位響應客戶需求

       當然，在應用領域上，NanoSight不僅局限于生物醫學領域中，在其他的領域也有廣泛的應用，如毒理學研究、材料分子學研究、納米氣泡、墨水、食品等。對此，馬爾文NanoSight產品專家梅潔先生表示：“說服客戶的不是我們的專家，而是馬爾文的產品本身。”

配備了先進NTA檢測技術的NanoSight擁有常規粒度儀不具備的強大功能：它能夠進行嚴格的質控，通過對觀察到的所有顆粒進行分析和計算，第一時間給出樣本粒度的詳細分布和濃度的具體信息。尤為關鍵的是，NTA的工作原理是通過將一束能量集中的激光穿過玻璃棱鏡對樣品（懸浮顆粒的溶液）進行照射，配以玻璃表面鍍鉻使背景信號最小化，可讓研究人員通過顯微鏡直接觀察到納米顆粒在溶液中的布朗運動，并拍攝影像，對每個顆粒的布朗運動進行跟蹤和分析，快速準確地計算出樣本中納米顆粒的流體力學半徑和濃度。相對于其他傳統技術，NTA能對懸浮液中粒徑分布范圍較寬的顆粒進行全方位表征，并且兼具極高的分辨率，對于粒度較為接近的顆粒仍然可以準確分析，特別適用于外泌體、蛋白質聚集、藥物傳輸、納米顆粒毒理、病毒和疫苗等復雜體系的相關研究。

另外，NanoSight還可以測定顆粒的數量，準確指示樣本溶液中單位體積顆粒濃度和顆粒數量，進行以量為基準的粒徑測試和分布測試。在目前各種注射劑中，對于懸濁液顆粒數量以及粒徑的要求已經越來越嚴格。

在操作方面，NanoSight大大降低了測試所需的時間和樣本量。通常，大型儀器（如流式細胞儀）在使用前都需要進行復雜的預熱和校準準備。由于使用斯托克斯-愛因斯坦方程的計算方式，NanoSight無需這樣做，它只要連上電源就能直接使用。并且由于NTA技術采用的是一個無需預先知道質量、折光度和顆粒材料的流體力學直徑測量技術，儀器可跳過繁瑣的標樣校準直接進入研究分析，為工作人員節省研究前的時間。

常規情況下，使用流式細胞儀測試一個樣本的平均時間為1-1.5小時，而目前使用馬爾文NanoSight，每個樣本的平均時間約為10分鐘，且分析結果全面、可靠。對許多客戶來說，這不光節約了大量的時間，加速推進整個科研進程，還為他們節省了寶貴的人力成本。

作者：梅潔，英國馬爾文儀器NanoSight產品專家