Science報道：新研究有望解決傳統CRISPR“太大”問題

　　過去6年，CRISPR從原本一個默默無聞的“細菌免疫機制”轉變成生命醫學領域炙手可熱的“香餑餑”，讓基因編輯以前所未有的精準度和便捷性完成多個突破。但是，最流行的CRISPR系統過于“龐大”，限制了其臨床應用。為此，有研究團隊對其進行了“刪減”，研發出了“苗條”版的剪輯工具。

The Cas9 enzyme, key to the CRISPR system, has a lot of fat that it can lose and still serve as a powerful tool. MELETIOS VERRAS/SHUTTERSTOCK.COM

　　傳統的CRISPR組件包括基礎版釀膿鏈球菌Cas9酶（SpCas9）、引導RNA（gRNA）。其中，SpCas9 會在gRNA的指引下與特定DNA結合，并對其剪切。在臨床應用中，許多研究團隊會構建“醫療包”——將Cas9基因和其他關鍵組件包裹進一個無害的病毒中，從而進入體內細胞實現遺傳缺陷的精準修復。

　　然而，考慮到SpCas9蛋白由1,368個氨基酸組成，體積太大不能通過病毒包裝和遞送。對此，科學家們希望設計出更精簡版的Cas9。

　　來自伯克利加州大學的結構生物學家David Savage帶領的研究團隊利用了一個“定向進化”的計劃設計了一個更“苗條”版的Cas9s，并于上周在冷泉港CRISPR年會上分享了最新的研究成果。

　　01、改造細則

　　他們將改造這一蛋白的方法稱為：通過迭代凝膠排阻方法最小化（Minimization by Iterative Size-Exclusion Recombination，MISER）。

　　首先，這項技術使用兩種酶系統化剪切SpCas9的基因序列，提取出其中編碼不同蛋白結構域的部分序列。

　　隨后，David Savage和團隊檢測這些分割開的基因序列，以驗證它們是否仍然保留著Cas9結合DNA的能力。他們將有能力的片段組合起來，并添加了特異的truncated options。

　　迄今為止，他們已經獲得了50萬種變體。“讓我們意外的是，‘縮減’后的Cas9可以忍受巨大的基因缺失，工作良好且靈活。” David Savage解釋道。

　　早前韓國科學家曾在空腸彎曲桿菌中發現了小型的Cas9酶CjCas9，由984個氨基酸組成。現在，這一最新改造再次“升級”，獲得的最小化的MISER Cas9突變體僅僅只包含880個氨基酸，約為原始SpCas9大小的三分之二。

　　02、突破和挑戰

　　MISER突變不一定可以實現傳統CRISPR-Cas9系統所能完成的一切潛能。其中一個障礙是：一些突變的Cas9s可以鎖定基因組中的特定靶點，但是并不能切斷DNA。

　　但是，這個功能缺陷的Cas9s同樣也是一個方便的工具，可以運送其他分子到達特定的目的地。一個特別強大的CRISPR技術——“堿基編輯”（base editing）則是利用該工具將一種關鍵酶運送至特定堿基，隨后實現單堿基的置換。

　　哈佛大學的化學家David Liu是全球率先研發出單堿基編輯技術的科學家，他認為此次David Savage團隊的研究是“新方法的一個早期應用，能夠促進基因編輯領域更接近于一個長期目標”。

The genome editor CRISPR cuts DNA with help from a guide RNA (green and red) and a Cas9 enzyme (outline) that latches onto a three-base sequence (yellow). KC ROEYER/UNIVERSITY OF CALIFORNIA, BERKELEY

　　03、其他“升級”版Cas9

　　CRISPR的“光環”很強大，從基因工具到臨床治療，這一技術有著巨大的潛能。然而，脫靶效應一直是該技術應用的瓶頸之一。如何降低脫靶效應？科學家們想出很多妙招。

　　2015年末，張鋒團隊通過改變構成化膿性鏈球菌Cas9酶的約1，400個氨基酸中的3個氨基酸，研發出“增強型”釀膿鏈球菌Cas9（eSpCas9），將“脫靶編輯”顯著減少至無法檢測到的水平。

　　2016年初，麻省總醫院的研究團隊猜測，降低Cas9酶與靶DNA之間的互相作用或許可以更加完全地消除脫靶效應。為了驗證推測，他們通過替換DNA鏈重組Cas9酶變體，最終獲得SpCas9-HF1，證實其可以顯著降低脫靶效應。

　　2017年，CRISPR“女神”Jennifer A. Doudna團隊利用單分子FRET（(F?rster resonance energy transfer）技術發現，Cas9與sgRNA形成的復合物中的REC3結構域負責感知靶向結合（target binding）的準確性，然后向REC2結構域發出信號，讓其為HNH核酸酶域打開一條通路，最終激活Cas9的“剪刀作用”。通過改變REC3部分，研究團隊設計出了一種改良版的、超精確的（hyper-accurate）Cas9——HypaCas9，有望克服脫靶效應。

　　2018年，David R. Liu團隊帶來了“升級版”的Cas9 變體——xCas9， 證實其在基因編輯時更靈活、更精確，可以靶向更多的基因位點，并減少“錯誤編輯”的風險。他們發現，相比于Cas9，xCas9錯誤編輯的概率降低了。

　　此外，科學家們還找到了靶向RNA的基因編輯酶C2c2（Cas13a）、CasRx（Cas13d）以及有任意切割單鏈DNA潛能的Cas12a（Cpf1）……未來，我們期待更多的基因編輯酶，給予更多的用途和潛能。