premRNA中存在的修飾及其對剪接影響

　　2018年10月7日 訊 /生物谷BIOON/--日前，作為“諾貝爾獎風向標”的拉斯克獎——拉斯克·科什蘭醫學特殊成就獎頒給了Joan Argetsinger Steitz教授（致敬Joan Steitz！2018年拉斯克特別成就獎獲得者），以表彰她在生物醫學領域，尤其是RNA生物學領域中所發揮的領軍作用。RNA在生命體內發揮著重要作用。早在1958年，Francis Crick提出的“中心法則”中就指出“DNA makes RNA makes protein”，可見RNA在遺傳物質從DNA到蛋白質傳遞中發揮著“橋梁”的作用。在隨后的60年中，尤其是真核生物中廣泛存在的基因剪接現象的發現，人們認識到mRNA的作用不僅僅是充當遺傳信息從DNA到蛋白質的“信使”，它們還可能是共轉錄和/或轉錄后調控的hub。

　　近年來，隨著測序技術的發展及其普及應用，尤其是表觀轉錄組（epitranscriptome）系統的發展，mRNA多種修飾形式及參與調控基因，進而影響細胞生長和發育的機制逐漸被揭秘。2016年Science雜志便做了一期關于RNA信號研究的專題報道，邀請了RNA研究領域中的三位大牛（原MIT，現就職于Yale大學的Wendy V. Gilbert教授，加拿大麥吉爾大學Nahum Sonenberg教授和杜克大學Bruce A. Sullenger教授）分別從mRNA修飾【1】，mRNA翻譯調控機制進展【2】及RNA在轉化醫學中的用途【3】分別進行論述。此后，關于mRNA修飾鑒定方法及其在細胞內已知功能的優秀綜述文章大量涌現。然而，關于mRNA前體即pre-mRNA的修飾及其功能的優秀綜述文章則鮮有報道。近日，mRNA修飾領域的大咖Wendy V. Gilbert教授和她的同事將她們對pre-mRNA中存在的修飾及其對剪接（splicing）影響的最新見解Pre-mRNA modi?cations and their role in nuclear processing【4】發表在最新一期Quantitative Biology期刊中。

　　文章作者首先對目前人類細胞核中存在的mRNA修飾酶及它們催化的核酸分子化學結構的變化進行了匯總（如圖1）。隨后對目前基于測序技術鑒定RNA修飾的方法進行了簡單的歸納概括，即分別是基于特異性抗體富集修飾mRNA的方法和基于化學試劑處理后終止反轉錄過程中鏈的延伸來鑒定RNA修飾的方法。

　　圖1人類細胞核內已知的mRNA修飾酶及其所催化的核酸化學結構變化

　　此外，作者指出為了分析mRNA修飾在mRNA整個生命周期即mRNA代謝中的作用，需要對mRNA修飾酶進行亞細胞定位方面的分析。如已有研究表明，m6A甲基轉移酶復合物（m6A methyltransferase complex）與細胞核內儲存剪接因子（splicing factor）的顆粒是共定位的，并且m6A甲基轉移酶復合物中每個組分的結合位點均可與RRACH motif中的m6A相結合，這一現象暗示了細胞核中的pre-mRNA存在m6A這種修飾形式。對于假尿嘧啶合成酶（pseudouridine synthases, PUS），目前在人類細胞中發現能對mRNA進行假尿嘧啶修飾的僅有3種酶，即PUS1,PUS7和TRUB1。這三種酶至少部分有細胞核定位信號或它們在細胞核內有異構體。如PUS7是與染色質相關的酶，尤其是與激活的Pol II啟動子和增強子相結合，這一現象表明PUS7應該作用于新生的pre-mRNA中。又如細胞核內滯留的非編碼RNA，如MALAT1在人類細胞中是被假尿嘧啶修飾的，這一結果表明假尿嘧啶合成酶在細胞核內是激活狀態的并可以作用與pre-mRNA中。此外，還有m5C和hm5C甲基轉移酶也有細胞核定位的信號。但這些酶具體修飾了mRNA生命周期中的哪個階段還是未知的。為了回答這一問題，可采用如PAR-CLIP的方法來分析RNA修飾酶結合RNA的位點，并結合修飾酶的亞細胞定位情況來綜合考慮。人類細胞中mRNA修飾酶在mRNA整個生命周期中的潛在功能如圖2。

　　圖2 mRNA修飾在mRNA整個生命周期中的潛在功能示意圖

　　另外，作者還對mRNA和pre-mRNA存在修飾形式的證據進行了匯總（表1）。由于pre-mRNA修飾鑒定技術的局限，除了m6A被確定是pre-mRNA共轉錄過程中的一種修飾方式外，其它修飾方式是否存在于pre-mRNA共轉錄過程中還未知。

　　表1 pre-mRNA中mRNA的修飾

　　目前已知的剪接過程一般是通過snRNP結合到剪接位點來完成的，但這種結合方式在哺乳動物細胞中一般是比較弱的，因此是可以被調控的。已有研究發現snRNAs的修飾可以影響剪接過程。此外，有證據表明pre-mRNA的修飾也會影響可變剪接。對于pre-mRNA修飾后調控的剪接過程，作者認為可能的分子機制主要有三種，即：

　　1）在RNA-RNA相互作用層面上，通過改變snRNA與pre-mRNA的相互作用來影響外顯子剪接；

　　2）在RNA-蛋白相互作用層面上，通過增強剪接因子與其在pre-mRNA結合位點之間的相互作用來改變剪接產物；

　　3）在pre-mRNA二級結構層面上，通過阻斷或暴露剪接因子結合位點的二級結構或剪接位點序列對snRNA結合部位的二級結構來實現調控（圖3A,3B和3C）。作者以m6A調控剪接機制為例，具體說明了這三種可能存在分子機制（圖3D）。

　　圖3 pre-mRNA修飾調控剪接的分子機制

　　文章的最后，作者認為當前關于pre-mRNA的修飾還知之甚少。除了m6A介導的剪切調控外，在新生的pre-mRNA中是否還存在其它修飾形式以及這些修飾是否或如何調控剪接過程也猶未可知。染色質相關RNA測序技術（chromatin-associated RNA sequencing）以及新轉錄RNA代謝標簽技術（matabolic labeling of newly transcribed RNA）是當前研究pre-mRNA修飾的主要方法。基于當前已發現的RNA修飾能廣泛影響RNA與蛋白質的結合來看，未來對pre-mRNA新修飾形式及機制的研究很可能會揭示核內pre-mRNA參與調控的新機理。