《Cell》:新技術揭示新生兒免疫系統發育模式

　　2018年，拓展質譜流式應用方向的文獻頻出。5月斯坦福大學Alex J. Kuo實驗室將質譜流式研究引入表觀修飾領域和衰老領域的熱潮還未過去，8月瑞典皇家理工學院Petter Brodin實驗室就實力搶鏡，在Cell上發表其研究“Stereotypic Immune System Development in Newborn Children”，將質譜流式的熱潮延續到新生兒免疫系統發育領域。接下來就讓小編帶著您一探究竟。

　　免疫系統的發育依賴于其暴露的環境因素。尤其是新生兒誕生后的前三個月暴露于什么樣的環境中對于其免疫系統發育有重要的影響：腸道，皮膚，血管的微生物組成都在其中扮演了重要的角色。在此期間的免疫系統發育情況與后期過敏，哮喘，I型糖尿病等免疫相關疾病的發病都有相關性。因此，新生兒免疫系統發育一直以來都備受重視卻又難有突破。其中很重要的一個原因是研究存在一個技術難點，那就是如何從新生兒如此少的血樣中得到足夠多的信息。在本文中，Petter Brodin實驗室應用了質譜流式技術（每次可以檢測40個通道以上）和ProSeek（Immunoassays，分析267種血漿蛋白）高通量的優勢，克服這一難點。

　　該研究抽取了50個早產兒(＜30周)和50個足月新生兒(＞37周)出生時的臍帶血及出生后1周、4周和12周的僅僅100ul血液，利用質譜流式技術就分析了58個常見免疫細胞亞群在人出生后不同時間點的發育情況，對比分析了早產兒和足月出生的新生兒之間的關系，并對影響免疫發育的因素進行了研究(圖一)。同時結合immunoassays Proseek分析267種血漿蛋白表達情況，系統性呈現出新生兒出生后免疫系統適應性發育概況。結果顯示：1 早產兒和足月新生兒在出生后免疫系統組成有著較大差異，之后，隨著免疫系統的發育，兩者的差異逐漸消失；2 免疫系統最初的發育遵循一個既定的路線；3 臍帶血的免疫亞群組成對于新生兒的免疫系統無預示作用；4 與微生物的相互作用對免疫系統的發育有重要影響，腸道微生物的失調會阻礙發育進程。

　　圖一:文章研究思路. 采用50個早產兒和50個足月新生兒出生時的臍帶血及出生后的1周，4周和12周的100ul血液，利用質譜流式技術和Proseek對新生兒免疫系統發育以及環境對其的影響進行解析.

　　該研究對于質譜流式應用具有很大的推進作用——將樣本量降低到僅僅100ul，而且在降低樣本量的同時還可以維系PBMC分群得到常見免疫亞群中最為稀少的DC細胞亞群。其改良后的Protocol對于今后質譜流式的應用，尤其是樣本量稀少的研究很有借鑒意義。該Protocol采用SmartTube或Cytodelics系列產品直接對血樣進行裂紅的方法代替常規Ficoll分離，降低了分離時所損失的細胞比例，提高了得率及活細胞比率。因此100ul血樣中的PBMC就足以在保證罕見免疫亞群不丟失的情況下完成分群。在這里需要提出的一點是該Protocol的成功應用同時得益于其Panel設計。由于研究的是常見免疫亞群的發育情況，Panel中所涉及到的38種marker都是T細胞，B細胞，NK細胞，DC細胞等亞群激活，分化等分群常見的表面蛋白，而沒有涉及到信號會受到SmartTube影響的趨化因子受體，磷酸化蛋白等抗原(圖二)。用Immunoassay作為手段進行趨化因子等蛋白濃度研究。

　　圖二:質譜流式Panel.

　　在研究的一開始，作者對早產兒和足月兒的臍帶血中血漿蛋白濃度進行研究，發現早產兒的臍帶血中的免疫系統有明顯炎癥反應特征：趨化因子CXCL11和IL8（CXCL8）高表達.而足月兒臍帶血中存在adipokine leptin高表達，反映在孕期的最后三個月，胎兒體內進行大量的脂肪累積。臍帶血的質譜流式分析顯示早產兒和足月兒的免疫系統組成具有各自明顯的特征：其主要的區別在于早產兒體內的嗜中性粒細胞比例偏低。之后作者對新生兒臍帶血(或外周血)和出生后一周的嬰兒血樣中免疫系統進行相關系數分析，發現在分析的21個亞群中，只有6個亞群顯示出相關性。在分析的81種血漿蛋白中，只有TNFRSF13B可以由臍帶血進行預測。為了進一步驗證兩者相關性，作者采用Barnes-Hut SNE (bhSNE)和Jensen-Shannon距離(JS Distance)分析，發現無論是細胞組成，血漿蛋白濃度還是細胞表型都無法由臍帶血作出預測。為了進一步研究整個免疫系統的發育過程，作者采用拓撲數據分析(TDA)對免疫系統發育初期的細胞頻率，血漿蛋白濃度等各類數據進行綜合系統性降維分析，使其可視化，并結合臨床數據，比如妊娠年齡，分析他們的關聯性。之后結合皮爾遜相關系數分析，創建了KNN圖譜。這些分析得出無監管計算模式下免疫系統發育的多參數圖譜。該圖譜中，臍帶血和新生兒外周血的簇群完全分離，說明臍帶血和出生后免疫系統發育無相關性(原文Figure3A)。早產兒和足月兒的簇群在一開始完全分離，說明在出生時兩者有著完全不同的免疫系統狀態，但是隨著年齡的增長，這些分支逐漸完全重疊，說明盡管起點不同，但兩者的發育遵循著共有的軌道(原文Figure3B)。

　　作者運用ANOVA模式分析了臍帶血和出生后不同時間點的血樣中的10個主要免疫亞群，發現隨著出生時間的延長，免疫發育遵循了相同的系統變化：嗜中性粒細胞的梯度遞減和Na?ve CD4、CD8陽性T細胞的增加(原文Figure4B)。跟臍帶血比起來，新生兒的負向調控免疫亞群比如MDSC類似亞群逐漸減少。以上這些發現進一步表明，無論是早產兒還是足月兒，出生后免疫系統的發育都系統性遵循著類似的軌跡。

　　之后作者關心的一個問題是出生后前三個月新生兒暴露的環境因素，對于免疫系統發育的影響。因此作者下一步的研究是將新生兒不同發育時期的血樣分別和其父母血樣用bhSNE進行研究對比。發現如下，在出生時，新生兒體內的單核細胞表型跟其父母已無明顯差異，之后隨著發育的進程，Na?ve B，NK細胞和DC細胞的表型差異逐漸消失，但是CD4、CD8陽性T細胞表型在研究所涉及的發育時間內依舊存在差異。這預示著不同免疫亞群發育遵循各自不同的軌道，出生后前三個月暴露于什么樣的環境中對于Na?ve B，NK細胞和DC細胞發育具有長期的影響。

　　文章結合多種高通量的研究方法，站在系統性的高度上，對于新生兒免疫系統發育過程進行細致研究。除了質譜流式技術以外，文中還采用了其他的一些研究方法，比如16s RNA Profiling研究腸道微生物對于免疫系統發育的影響，RNASeq對1周和12周的嬰兒血液樣本進行轉錄組分析等。結合所有發現，作者提出了一個環境因素如何影響免疫系統發育的假說(圖三)。假設對于免疫系統輸入一個刺激，誘發免疫系統整體會往一個方向做出反應。在此背景下，輸入第二個與第一個刺激引發相反反應的刺激后，免疫系統會做出針對兩個刺激的反應，但是這兩種反應彼此限制。那么，如果刺激足夠多，引發的表型可能性會減少，發育軌跡便可以預測。

　　圖三: 新生兒免疫系統發育假說