深度解讀熒光定量PCR儀所運用的技術

 　　深度解讀熒光定量PCR儀所運用的技術

　　熒光定量PCR儀所用到的實時熒光定量PCR技術是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測，而實現對起始模板定量及定性分析的目的。在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖，達到監測PCR產物擴增量的目的。

　　一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化；而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級增加，PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，因此根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，故選擇該階段進行定量分析。為了較方便的進行DNA拷貝數的定量，在實時熒光定量PCR技術中引入了三個非常重要的概念：基線、熒光閾值和Ct值。

　　基線：是指在PCR擴增反應的最初數個循環里，熒光信號變化不大，接近于一條直線，該直線即是基線。

　　熒光域值：一般將PCR反應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR反應3-15個循環熒光信號標準差的10倍，熒光域值設定在PCR擴增的指數期。

　　Ct值：表示每個PCR反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。各模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小，反之亦然。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標難曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

　　熒光定量PCR儀的實時熒光定量PCR技術是DNA定量技術的一次飛躍。運用該項技術我們可以對DNA、RNA樣品進行定量和定性分析。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較。除此之外還可以對PCR產物或樣品進行定性分析，利用特異性探針進行基因型分析及SNP檢測等。目前實時熒光PCR技術已經被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域，其中最主要的應用集中在以下幾個方面：

　　1.DNA或RNA的jue對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。

　　2.基因表達差異分析。如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等)，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA芯片或差顯結果的確證。

　　3.基因分型。例如SNP檢測，甲基化檢測等。