調節骨髓間充質干細胞的微環境因素研究進展

　　19世紀六七十年代，Bianco等發現骨髓中含有一種能自身繁殖的間質細胞群，簡稱成纖維細胞集落形成單位。研究發現，這是一類廣泛存在于骨髓及間葉組織中的細胞，具有多向分化潛能，學者們將此類細胞稱為間充質干細胞。MSC周圍的細胞和微環境精確調節間充質干細胞的動態平衡。微環境因子失調會引起間充質干細胞功能增強或減弱。骨髓MSC功能減弱會導致組織再生的障礙，如骨質疏松；反之，MSC功能增強會導致間充質組織異位生長，如異位骨化。無論是獲得性還是遺傳性異位骨化，為通過模型研究MSC功能增強與疾病的關系提供了可能。

　　骨髓MSC常被作為細胞再生療法的理想供體細胞，但只有少數研究關注活體微環境對骨髓MSC的作用。了解微環境因子失調如何導致骨髓間MSC下游的病理生理過程，將為最終明確骨髓MSC的分化及生理功能打下基礎，下面對影響骨髓MSC分化的微環境因素進行綜述。

　　影響骨髓間充質干細胞的微環境因素

　　炎癥因子

　　腫瘤壞死因子α是一種促炎性細胞因子，它可以抑制或促進骨髓MSC的成骨分化。研究表明，TNF－α可以抑制MSC的成骨分化和骨骼的形成。在雌激素缺乏致骨質疏松的小鼠模型中，TNF－α可以通過β－蛋白信號通路抑制3B腦信號蛋白，進而抑制骨髓間充質干細胞的成骨分化。TNF－α通過減少miR－17的表達、上調泛素連接酶水平，抑制人牙周韌帶組織來源的間充質干細胞成骨分化。Yang等發現TNF－α在強直性脊柱炎細胞環境中促進人骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化，因肽基精氨酸脫氨酶Ⅳ型的沉默而衰減。研究發現TNFα和白細胞介素－1β可以刺激骨外植體中培養的人間充質干細胞組織非特異性堿性磷酸酶的活性和鈣化。TNF－α和脂多糖也可以刺激堿性磷酸酶活性，在有或無骨形態發生蛋白成骨細胞培養基中培養的骨髓間充質干細胞都可使骨基質鈣化。同樣，細胞因子激活的炎癥中，人骨髓間充質干細胞促進成骨細胞的增殖、遷移、分化和鈣化。在燒傷誘導的異位骨化中，包括TNF－α在內的炎癥因子對燒傷小鼠脂肪來源的間充質干細胞有促進成骨的作用。

　　其他炎性因子對于MSC發揮了相似的作用。IL－1β對成骨細胞分化有抑制作用，但可以增強在體外培養的人骨髓間充質干細胞鈣化。IL－17A和IL－17F可以增強人骨髓間充質干細胞的成骨分化。炎癥因子能影響間充質干細胞的干性。通過核因子kB信號通路介導的卵巢切除的小鼠中轉化生長因子β超家族抑制蛋白7的活化，說明干擾素－γ和TNF－α能協同地損害間充質干細胞的自我更新和分化。雖然IFN－γ調節人骨髓間充質干細胞的分化潛能，但它對人骨髓間充質干細胞的自我更新能力并沒有發揮重要的影響作用。無論是人類還是小鼠，在異位骨化中IL－6血清濃度、神經炎癥因子的水平以及物質P含量都有所增加，這是由于疾病過程中炎癥的持續性作用。基質細胞衍生因子1是一種趨化因子，它通過趨化因子受體調節細胞交通和歸巢，在向靶組織招募間充質干細胞中起著重要的作用。但在大鼠骨折模型中，SDF－1對間充質干細胞增殖或成骨分化沒有必要作用。SDF－1能夠調節BMP－2誘導的人源和鼠源的骨髓間充質干細胞的成骨分化。

　　綜上所述，炎性因子特別是促炎性細胞因子，對各種不同情境中的不同譜系間充質干細胞增殖或成骨分化起著至關重要的作用，部分細胞因子可以幫助調節間充質干細胞自我更新。

　　細胞因子和多肽

　　許多細胞因子調節間充質干細胞的干性和成骨分化，包括生長因子、激素和一些小分子。在創傷引起的異位骨化患者中，許多細胞因子的水平增高，包括BMP－1、生長分化因子11（GDF11）和轉化生長因子β1（TGF－β1），而其他如BMP4，BMP5和生長分化因子10（gdf10）則水平降低。BMP－2是一種骨誘導蛋白，在異位骨化中起著重要的作用。血小板衍生生長因子（PDGF）在組織損傷后作為間充質干細胞的趨化因子。分離的創傷或多發性創傷患者（與異位骨化相關）血清誘導人工培養的間充質干細胞的增殖，在一定程度上與PDGF濃度相關，并且骨髓中間充質干細胞數量與血清血小板衍生因子AA或BB濃度也是相關的。

　　富血小板纖維蛋白緩慢持續釋放多種自體生長因子，Wang等發現在體外PRF刺激骨髓間充質干細胞增殖和成骨，并且與無PRF組相比，間充質干細胞與PRF共同注入嚴重聯合免疫缺陷小鼠組，會導致更多、更致密的新異位骨。雌激素通過維持成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨重吸收來維持骨量。Chen等發現在雌激素治療絕經后婦女骨質疏松時，雌激素受體和ALP的mRNA表達增加，但骨鈣素和IL－6減少，說明雌激素可能對骨質疏松女性骨髓間充質干細胞的成骨細胞分化有顯著的影響。研究發現雌激素受體基因多態性與脊柱后縱韌帶骨化有關，并且3．17β－雌二醇刺激培養的患者脊柱后縱韌帶骨化，可以促進骨鈣素的形成，它是絕經后骨質疏松癥患者骨形成的特異性標記。

　　細胞因子還可以幫助維持間充質干細胞干性。堿性成纖維細胞生長因子與維護更高程度的人骨髓間充質干細胞干性有關。在體外堿性成纖維細胞生長因子刺激小鼠骨髓來源的間充質干細胞，可以影響干性的程度。bFGF處理后的間充質干細胞植入體內時，招募宿主細胞，具有激活內源性再生機制的能力。血管內皮生長因子在人類間充質干細胞介導的心肌再生中起關鍵作用。C3H／10T1／2的間充質干細胞細胞系，其自身分泌細胞因子，如胰島素樣生長因子－1，這有助于調節組織再生。

　　也有研究認為，bFGF會降低精原干細胞／骨髓基質干細胞的干性，可能由于bFGF可以促進細胞增殖，而不是自我更新。bFGF刺激SSCs／Bone

　　MSC在體內沒有骨髓處擴展增殖形成骨，提示bFGF可能將干細胞推向成骨的狀態。總的來說，多種細胞因子都與間充質干細胞功能增強有關，即增強間充質干細胞自我更新和增殖能力，或增強成骨細胞的分化。

　　細胞外基質

　　細胞外基質對保留間充質干細胞干性發揮重要作用。Xiong等發現，脫細胞基質涂層能幫助維持小鼠脂肪來源培養的干細胞的干性。Rakian等將人類原發性間充質干細胞培養在骨髓來源無血清的細胞外基質，比較集落形成和分化，發現骨髓來源細胞外基質提供了一個獨立的微環境，它維持間充質干細胞集落形成的能力，同時維持干性。人類基質細胞衍生的細胞外基質能提高人骨髓間充質干細胞增殖能力，維持他們的分化能力。

　　對于人類骨髓來源的間充質干細胞的分化，Hoch等建立了一種細胞分泌的、脫細胞的細胞外基質，其中以糖蛋白為主，它提示以趨化因子和生長因子的形式支持細胞黏附分子。這個基質可能指示細胞的命運，通過展示了一個復雜的生理相關的環境可以更好的保護產生表型的間充質干細胞，并穩定成骨細胞的表型。Gawlitta等發現，作為支架，未接種的脫細胞軟骨基質本身很少引起軟骨內成骨的再生。而預接種人骨髓來源軟骨中的間充質干細胞在脫細胞水解乳蛋白培養基上，可以恢復其在異位骨化的潛能。富含半胱氨酸基質信號蛋白是一種在癌細胞中高表達的成分，也可以在骨髓來源的間充質干細胞分泌物中發現。CCN1能調解Wnt信號通路蛋白來源的間充質干細胞細胞系的成骨分化，并且可以促進體內外小鼠軟骨初代間充質干細胞成軟骨分化。

　　人造生物材料也可以高仿一些細胞外基質的微環境效應。例如，磷酸鈣中的羥基磷灰石泡沫可以代替骨。Viti等用基因表達芯片來研究磷酸鈣誘導的體外人骨髓來源間充質干細胞分化中可能涉及的通路，以及與成骨分化相關的一些基因表達增多，包括骨橋蛋白抗體、唾液酸蛋白和一些骨形態發生蛋白。已經有許多關于構建人工生物材料的嘗試，通過用重組細胞外基質蛋白和多肽涂覆材料表面或采用脫細胞同種異體或異種組織作為支架，以求更充分的模仿間充質干細胞生物學效應。在一般情況下，前者未能捕捉到天然細胞外基質的復雜組成和結構特征，后者則擔心重復性、可用性和免疫反應。

　　力學因素

　　研究細胞外基質的力學因素或生物物理方面是有必要的，因為微環境的這一方面也對干細胞行為產生重要影響，特別是間充質干細胞的譜系特異性分化，對于開發組織工程和再生醫學的生物材料也是必不可少的。骨髓間充質干細胞的體內力學微環境是由內在剛度、組成、細胞外基質的位形和外在對基質施壓負重（如流體流動、壓縮、靜水壓力和張力）所確定的。間充質干細胞有大量的膜蛋白和細胞骨架成分，可以感知和響應它們所處的力環境。但對體內確切的力機制仍知之甚少，目前尚無關于異位骨化背景下間充質干細胞力學機制的具體研究，也沒有可以用來進行系統研究完善的體內系統。目前為止大多數研究探討骨髓間充質干細胞力生物學時已經使用2D／3D體外試驗。

　　體外實驗均表明基質或基質剛度在調節骨髓間充質干細胞向特定譜系分化方面起到關鍵作用。接種到軟基質骨髓的間充質干細胞更多的向脂肪細胞和軟骨細胞分化，而接種在剛度基質的骨髓的間充質干細胞有較強的肌性分化潛能，這種差別不依賴于化學和生物化學誘導劑。牽引力和剛度基質介導與整合素結合，直接作用于間充質干細胞譜系改變。相比于剛度，盡管細胞形狀已經被證明可以影響細胞分化方向，但在文獻中仍無法確定。

　　流體剪切力、靜水壓、周期性壓力和其他外在的機械力學因素，也可以影響細胞的行為。振蕩流體流動可以調節干細胞，灌注系統有促進間充質干細胞成骨的作用。靜水壓是一種不變形的機械性刺激，可以增加人類骨髓基質細胞軟骨形成基因的表達，而對成骨基因無明顯影響。它可以減少骨髓鈣化和長期瓊脂培養的髕下脂肪來源的間充質干細胞。兔骨髓來源間充質干細胞受壓是對軟骨預形成非常強大的刺激。在無外源性生長因子刺激的間充質干細胞中，壓力可以增加軟骨形成基因的表達，提示單純壓力也可以誘導軟骨形成。

　　總體來說，即使有一些初步證據，仍需要進一步的研究來清晰地解釋間充質干細胞是如何對體內復雜的機械刺激感知和做出反應。

　　其他微環境因子

　　許多其他因子也涉及了間充質干細胞種群的維護和分化。例如，瘦素是一種維持能量平衡的脂聯素，在小鼠骨髓間充質干細胞中至少表達一個亞群，在間充質干細胞成骨分化的外周調控中起著重要的作用。胎球蛋白A主要在肝臟合成，可以降低割腱大鼠發生異位骨化的可能。Tuylu等在鈣化組織中發現了豐富的胎球蛋白A。這些數據提示，胎球蛋白A可能是強直性脊柱炎異位骨化過程中反饋回路的一部分。1，25－二羥維生素D是維生素D最活躍的代謝產物，被認為是成骨細胞分化的活化劑，因為它協同肝細胞生長因子，誘導h間充質干細胞分化。神經類表皮生長因子樣蛋白1對軟骨細胞具有高度特異性，在體外通過調節Runt相關轉錄因子2，誘導間充質干細胞向成骨細胞分化。在人體多能干細胞中，Nell－1增加軟骨細胞基因的表達，并在加快人類多能干細胞軟骨細胞分化過程中大大增強TGF－β3和BMP－6的作用。Nell－1已成為治療骨質流失的一種可行治療方法。

　　抑制環氧化酶－2，會導致前列腺素E2合成減少，從而抑制小鼠間充質干細胞軟骨細胞分化。研究猜測改變n－3／n－6多不飽和脂肪酸的比例會減少PGE2的合成，預防異位骨化或作為異位骨化的替代治療。缺氧誘導因子是一種對低氧做出反應的主要調節因子，在小鼠骨髓間充質干細胞的成骨軟骨分化中起關鍵作用。研究發現缺氧誘導因子可以抑制外傷造成的（燒傷／割傷）或遺傳性的異位骨化。藥理抑制劑缺氧誘導因子可以在不同的異位骨化模型中有效減少異位骨的形成。Ｚhou等還發現，HIF－1α聯合BMP2可以增加間充質干細胞細胞系的軟骨細胞分化。這為軟骨組織工程中增強維持軟骨表型提供了一種方法。

　　靶向微環境對骨髓間充質干細胞作用

　　骨髓間充質干細胞功能增強會導致間充質組織異位生長，如異位骨化。臨床上間充質干細胞病理性增殖和成骨分化常見于骨科創傷、燒傷、中樞神經系統的創傷、進行性骨化纖維發育不良及進行性骨發育異常。在病理條件下骨髓間充質干細胞誘導分化為成骨細胞的過程受到多條信號通路的調控，包括BMPs／Smad通路、Wnt通路、絲裂原激活蛋白激酶通路和鈣離子通路等。在BMPs／Smad通路，其中BMP－2具有促進間充質干細胞增殖及成骨分化的作用。研究發現，當骨形態發生蛋白mRNA表達量增加時，堿性磷酸酶、骨鈣素、Smad及l型膠原等表達顯著增高，骨髓間充質干細胞發生明顯的成骨分化。BMPs有兩種受體，當BMPs激活Ⅱ型受體后，I型受體磷酸化，隨后激活下游Smad1／5／8蛋白。Smad1／5／8同受體結合在配體上，磷酸化后與smad4形成異二聚體，然后轉入細胞核后結合到目標啟動子序列，誘導成骨特異性轉錄因子Runx2等。

　　Wnt通路是調節骨髓間充質干細胞自我更新和分化的關鍵途徑。當Wnt通路被激活后，Wnt蛋白首先與細胞表面低密度脂蛋白相關受體蛋白和卷曲蛋白復合物結合，促進β聯蛋白聚合，激活T細胞因子、淋巴增強因子介導的基因表達。MAPK通路是調控骨髓間充質干細胞成骨分化的重要途徑之一。該通路中細胞外信號調節激酶、c－Jun氨基端激酶和p38通路參與了骨髓間充質干細胞的成骨分化。MAPK通路激活后，誘導轉錄因子Runx2磷酸化及轉錄因子Osterix表達，同時調控BMPs和纖維生成因子2，促使骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞。鈣通路是以鈣離子為信號調節骨重建的關鍵通路。成骨細胞和破骨細胞表面有可以感受細胞內外鈣離子濃度的變化的鈣敏感受體。研究發現細胞外鈣離子濃度升高時，可以提高成骨分化標志物水平，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化。

　　BMPs／Smad通路、Wnt通路、MAPK通路和鈣離子通路等多種通路協同調節間充質干細胞的增殖和成骨分化，維持機體的骨的新陳代謝。有多種因素影響間充質干細胞的增殖和分化，基于目前的數據，可以得出這樣的結論：并不是所有的微環境因素都是平等的，一些因素可以增加間充質干細胞向成骨細胞分化的能力，另一些可以促進間充質干細胞的自我更新，還有的可以同時發揮這兩項作用；許多微環境因子的生化效應是依賴背景條件的。這些因素可能相互交叉，并形成一個最小的結構性的功能單位，從而調節間充質干細胞和下游分化的穩態。目前微環境因素在間充質干細胞分化中的作用大部分仍是未知的，許多備選微環境因素可能涉及到調節生理或病理生理中間充質干細胞功能，所以很難分析其中的相互作用關系。為了解決這個問題，將微環境因子作為一種局部功能性調節單位進行研究是比較有潛力的方法，它與干細胞最小結構單位的概念相似，可以協調間充質干細胞穩態和下游分化。