蛋白質組學實用分析技術一覽

分析其實也屬于技術的一部分，且在蛋白質組學研究中顯得尤為重要，因為蛋白質組學研究提供的數據是生物學上最龐大的，而且蛋白質組比基因組具有更大的復雜性，因此蛋白質組信息學更有挑戰性。今天小編先拋磚引玉地介紹幾個常用的分析方法和軟件。

蛋白質定性分析

蛋白質定性分析通常是指利用質譜法進行蛋白質鑒定和序列分析。蛋白質定性分析分為top-down分析和bottom-up分析兩種策略。目前，bottom-up分析策略被更廣泛的應用于蛋白質定性分析工作。

根據使用儀器可分為：MALDI-TOF/TOF、LC-ESI-MS/MS

根據樣本類型可分為：蛋白質全譜分析（即shotgun分析） 、蛋白質膠條/混合液分析、蛋白質膠點分析

蛋白質全譜分析

定義：蛋白質全譜分析也可稱為質譜shotgun分析，是指組分分析，能夠鑒定出盡可能多的肽和蛋白質分子。

原理：將溶液內蛋白質分子或SDS-PAGE條帶的復雜混合物酶解成肽段混合物，通過液相色譜分離。串聯質譜測試，最后用相應的數據庫進行檢索匹配，可同時鑒定成百上千種蛋白質。主要應用于某一生理狀態下組織、細胞或者細胞器中所有表達蛋白質的鑒定。

蛋白質膠條/混合液鑒定

定義：利用LC-ESI-MS/MS蛋白鑒定技術對膠條樣本（即SDS-PAGE樣本）、IP、Co-IP、Pull-down等純化溶液等中等復雜樣本進行蛋白鑒定。

原理：利用電噴霧（ESI）技術將樣品以離子化的方式從液滴表面蒸發，進入質量分析器。主要應用于蛋白質或多肽鑒定。

蛋白質膠點鑒定

定義：利用MALDI-TOF/TOF蛋白鑒定技術對考/銀染的2D或DIGE膠點樣本或者較純的蛋白樣本進行蛋白鑒定。

原理： MALDI-TOF/TOF（Matrix – Assisted Laser Desorptiob/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜）MALDI的原理是將樣品均勻包埋在基質中，基質吸收激光提供的能量而蒸發，攜帶部分樣品分子進入氣相，并將一部分能量傳遞給樣品分子使其離子化。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，從而檢測離子。 也主要應用于蛋白質或多肽鑒定。

蛋白質相對定量分析

相對定量的目的是測定目的蛋白在兩個或多個樣本中的表達量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的表達量。例如，如果研究項目中包括處理過的和未經處理的對照樣本，通常可以將未經處理的樣本指定為基準，規定其目的蛋白濃度為100%，經處理的樣本的定量結果除以對照樣品的定量結果，就可以計算各個處理樣本的蛋白含量相對于未處理樣品的百分比。

蛋白質絕對定量分析

目前基于質譜的絕對定量蛋白質組學研究主要是指靶向蛋白質組學。靶向蛋白質組學分析，是指對目標蛋白質（或修飾肽段）進行定性和/或定量分析，或者用于驗證大規模蛋白質組學的結果。基于質譜的靶向蛋白質組學分析方法，由于沒有物種限制并具備多目標同時分析能力等優勢，在相關研究領域已逐漸受到越來越多的關注和應用。其技術方法經歷了從傳統的SRM/MRM（選擇性/多反應監視，selected / multiple reaction monitoring）到PRM（平行反應監視，parallel reaction monitoring）的發展歷程。

絕對定量蛋白質組學應用方向： 驗證定量蛋白質組學結果、驗證翻譯后修飾蛋白質組學結果、 目標蛋白質絕對/相對定量分析、診斷標志物靶向篩選、診斷標志物驗證與絕對定量、驗證基因表達產物。

PRM

定義：PRM是一種基于高分辨、高精度質譜的離子監視技術，能夠對目標蛋白質、目標肽段（如發生翻譯后修飾的肽段）進行選擇性檢測，從而實現對目標蛋白質/肽段進行絕對定量。

原理：首先利用四級桿質量分析器的選擇檢測能力，在一級質譜中（Q1）選擇性地檢測目標肽段的母離子信息；隨后在collision cell中對母離子進行碎裂；最后利用高分辨、高質量精度分析器在二級質譜中檢測所選擇的母離子窗口內的所有碎片的信息。這樣即可對復雜樣本中的目標蛋白質/肽段進行準確地特異性分析。

蛋白質翻譯后修飾分析

翻譯后修飾(Post-translational modification, PTM)是指對翻譯后的蛋白質進行共價加工的過程，通過在一個或多個氨基酸殘基加上修飾基團，可以改變蛋白質的理化性質，進而影響蛋白質的空間構象和活性狀態、亞細胞定位、折疊及其穩定性以及蛋白質-蛋白質相互作用。許多至關重要的生命進程不僅由蛋白質的相對豐度控制，更重要的是受到時空特異性和翻譯后修飾的調控，揭示翻譯后修飾的發生規律是解析蛋白質復雜多樣的生物功能的一個重要前提。常見的翻譯后修飾包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等等。

修飾蛋白質組學：質譜是鑒定蛋白質翻譯后修飾的重要方法，其原理是利用蛋白質發生修飾后的質量偏移來實現翻譯后修飾位點的鑒定；同時，由于翻譯后修飾的蛋白質在樣本中含量低且動態范圍廣，檢測前需要對發生修飾的蛋白質或肽段進行富集，然后再進行質譜鑒定。

修飾蛋白質組學技術方法及應用：

生物信息學分析

在這個大數據時代，生命科學的研究領域由還原論的研究方法逐步向系統水平過渡，作為高通量的各種組學研究手段在生命科學的研究中發揮著越來越重要的作用，并積累了海量的數據。如何從海量的生物數據中挖掘出有用的信息并指導生命科學的研究是整個生命研究領域的挑戰。生物信息學在這個過程中起著越來越重要的作用。

生物信息學在蛋白質組學中的應用很廣泛，通過雙向凝膠電泳、生物質譜等方法和手段對蛋白質的種類、數量、結構和功能進行最后確定，也可對蛋白質的結構和功能進行預測。隨著基因組研究的進一步拓展，蛋白質研究技術的不斷革新和數據的不斷積累，生物信息學工具也在日益完善，為蛋白質組學提供更豐富的資料。

蛋白質組學生物信息學主要內容：

蛋白功能注釋：亞細胞結構定位、GO分類、KEGG通路途徑、蛋白結構域、KOG/COG分類、FunCate2分類。

功能富集分析：使用費歇爾確切檢驗方法，描述特定屬性蛋白群體（差異表達的蛋白、發生修飾的蛋白等）潛在調控的生理過程。分析包含：GO分類富集、KEGG通路富集、蛋白結構域富集、蛋白復合物富集。

功能富集聚類分析：使用分層聚類的方法，研究不同實驗處理條件下對特定屬性全蛋白群體調控生理過程的影響。

表達模式聚類分析：使用Mfuzz聚類方法對蛋白在不同處理條件（不同處理時間或藥物濃度）下表達譜的聚類分析。直觀的反應出處理時間或藥物濃度與蛋白表 達水平的關系。對得到的不同表達模式分類可以做進一步的功能富集聚類分析，揭示藥物潛在作用的蛋白與生理功能。

修飾位點motif分析：分析翻譯后修飾位點附近氨基酸分布情況，預測潛在與該種修飾類型相關的保守序列區間。通過與蛋白結構域的聯系，為研究該種修飾類型作用和調控機制研究提供參考依據。

蛋白質序列分析

Compute pI/Mw蛋白質序列的理論等電點、分子量的計算

CATH通過自動、手動方式進行蛋白質結構相關性的系統分類，“CATH”是以下四個單詞的首字母的組合：

• Class，類 —源于二級結構的最高級別的分類

• Architecture，構造—獨立于拓撲結構的二級結構排列描述

• Topology，拓撲結構—參照已知的折疊及觀測的結構進行拓撲分析

• Homology，同源—結構間相同的拓撲布局、不同的二級結構（與功能相似性相關）描述

CRASP（Correlation Analysis of Sequences of Proteins）蛋白質序列的相關分析

FPAT檢索分子序列數據庫模式的簡易方法

Hydropathy Plot(GIF image) 繪制親疏水圖

MOTIF蛋白質序列模式檢索

RandSeq隨機的蛋白質序列生長子

REPRO蛋白質重復片斷識別服務器

SALSA蛋白質、核酸序列相似性檢索

SignalP在不同的物種中預測信號肽及酶切位點

SIM 由用戶定義的最佳兩序列對比

TMpred蛋白質跨模區預測、定位，該方法基于統計學結果，通過權重矩陣打分進行預測分析

Coils對比分析具有雙股卷曲結構的序列同源性打分，進而計算適于采用該結構的序列的幾率

GuessProt選擇SwissProt蛋白的等電點、分子量

MassSearch蛋白質消化后的聚集檢索

Phospepsort磷酸化位點分類

SAPS蛋白質序列統計分析

Sleuth氨基酸構象及可及性分析

PEDANT蛋白質提煉

PROVE蛋白質原子體積計算

Naccess(ASA for proteins) 利用Lee & Richards方法描述分子表面性質的計算程序，能夠計算蛋白質的表面可及性

蛋白質空間構象、同源模建

DOCK分子對接程序

Cn3D分子空間構象的三維模式展示程序

PROCHECK已知蛋白質結構的立體化學參數評價，通過分析殘基間幾何構象繪制圖表。

Barton Group Home of the programs: AL, AMPS, AMAS, STAMP, ASSP and SCANPS.

WPDB 2.0蛋白質三維結構展示程序

CCP4蛋白質晶體解析程序

X-PLOR 適用于計算結構生物學的程序系統，通過經驗能量函數及實驗數據的限定，進行大分子空間構象的開發，該程序主要用于X-射線衍射數據及NMR核磁共振數據分析。

O 蛋白質結晶程序

MACAW (sequence alignment)多序列對比，功能塊的定位、分析、編輯。

PDBtool- Macromolecular Structure Browsing and Verification - v1.0 Beta 蛋白質數據庫的檢索

Swiss-Model: Automated Protein Modelling Server 基于結構知識的蛋白質自動同源模建程序

VMD 1.0 (visual Molecular Dynamics)用于UNIX操作系統的、易于操作的分子圖形學軟件

XRayView適用于X-射線衍射晶體數據的交互式動態分析，涉及晶胞的構建，晶格的確定，系統消光，旋轉攝影，空間群的確定及Laue群對稱性等。

PDB （PROTEIN DATA BANK） 由實驗決定的生物大分子三維結構的數據庫

SCOP基于序列、結構的蛋白質結構分類數據庫

NRL-3D源于PDB與PIR數據庫的綜合信息檢索

CHEMICAL STRUCTURE DATABANK基于蛋白質化學結構分析

MMDB基于蛋白質結構數據庫，由NCBI提供的分子模建數據庫

RASTER3D光柵3D技術提供高質量的蛋白質及其他分子的光柵圖像，利用有效的Z-buffer法則進行球狀、三角、柱狀展示，借助借助PDB提供的原子坐標進行飄帶、球、球棍、鍵等的展示

vmd分子圖像程序

Swiss-Model蛋白質自動同源模建

蛋白質二級結構預測、分析

DSC（Discrimination of Protein Secondary Structure Class） 蛋白質二級結構分類識別

DSSP 由Wolfgang Kabsch 與Chris Sander建立的標準的蛋白質二級結構分類，對蛋白質結構數據庫PDB中的蛋白質進行歸類

EpiMatrix/HIV 利用特定的抗原矩陣線性檢索抗原表位

PredictProtein蛋白質二級結構預測

Garnier-Robson-Osguthorpe Secondary Structure Prediction 利用Garnier等建立的模型進行蛋白質二級結構預測

NAMDIllinois大學中的理論生物物理學會建立的提供高可信度的分子動力學模擬軟件包

nnPredict蛋白質二級結構預測

PSSP蛋白質二級結構預測

Predator來自單序列或一套序列的蛋白質二級結構預測

SIMPA96 SECONDARY STRUCTURE PREDICTION蛋白質二級結構預測

SSPRED蛋白質二級結構預測

蛋白質相互作用分析