Nature:磁共振影像示蹤“特洛伊木馬”細胞攻擊殘余腦腫瘤

　　在科學技術蓬勃發展的今天，大多數腫瘤經臨床規范化治療后，患者的生存期及生存質量均有較為顯著的提升，然而，對于腦膠質瘤而言，對它的療效在近30年來卻沒有得到很大的改觀，腫瘤患者總體預后依然較差，5年生存率不足10%，中位生存期僅為12-15個月，被認為是目前最難治愈的腫瘤之一。那么，是什么原因阻擋了腦腫瘤醫生手術刀刃的鋒芒？又是什么原因阻礙了藥物到達腫瘤的步伐？究其原因，這主要來自于腦膠質瘤兩個獨特的生物學特性導致的，一方面，膠質瘤細胞主要沿著神經纖維束浸潤生長，在顱內呈彌漫性分布，沒有清晰的腫瘤邊界，導致手術難以切除所有的腫瘤細胞；另一方面，腦膠質瘤還受到顱內血腦屏障的保護，使得絕大多數小分子化療藥物和大分子生物藥物無法進入腫瘤組織，特別是血腦屏障沒有破壞的腫瘤區域，這大大限制了腫瘤藥物的療效。對于膠質瘤的治療，目前臨床上主要以手術切除為主，輔以包括放射治療和藥物治療在內的綜合治療，如何在保護腦功能區的基礎上盡可能多地切除腦膠質瘤細胞，并有效防止殘余腦膠質瘤的復發是取得腦膠質瘤治療成功的關鍵。

　　中國科學院深圳先進技術研究院鄭海榮研究團隊發現利用免疫系統中重要的中性粒細胞，作為穿越血腦屏障的靶向細胞載體，同時結合具有磁共振成像（Magnetic resonance imaging, MRI）性能和載藥能力為一體的磁性介孔氧化硅納米顆粒，成功實現了對術后腦膠質瘤的診療可視化。這一研究成果于2018年11月14日發表在Nature Communications。

　　中性粒細胞是一種典型的分葉核白細胞，在炎癥反應過程中，可被激活，并在血管內翻轉、粘附、爬行并快速向炎癥組織靶向聚集。MRI技術具有無創、高空間分辨率和高穿透深度等優勢，被廣泛用于結構影像與細胞示蹤研究。值得注意的是，中性粒細胞是一種吞噬性的末端分化細胞，半衰期為6-7小時。因此，MRI納米診療探針的信號強度不會隨著細胞增殖和細胞外排而減弱，這對于理解磁共振造影劑標記后的中性粒細胞特性、生物學效應及其膠質瘤診療應用具有重要的意義。

　　研究團隊利用中性粒細胞的生物學特性，將載阿霉素的磁性介孔氧化硅納米顆粒與中性粒細胞共孵育，得到具有MR成像性能的載藥中性粒細胞（細胞藥物輸運體系）。當通過靜脈注射到達術后腦膠質瘤炎性區域后，高度激活的載藥中性粒細胞可形成中性粒細胞胞外誘捕網（Neutrophil extracellular traps，NETs），同時釋放載藥納米顆粒并進入到浸潤的腫瘤細胞，達到磁共振影像示蹤“特洛伊木馬”細胞抑制腦腫瘤復發的目的（圖1）。

圖1：a）細胞藥物輸運體系制備示意圖；b）術后膠質瘤小鼠治療示意圖。

　　為了評價中性粒細胞在吞噬載藥納米顆粒后是否還保持其炎癥趨化能力，研究人員將腫瘤壞死因子TNF-a刺激的bEnd.3內皮細胞鋪在Transwell的下室（圖2a）。當下室為無血清的培養基時，幾乎觀察不到細胞藥物輸運體系遷移通過Transwell膜，然而當下室為含有TNF-a的無血清培養基時，隨著時間的延長，穿過膜的中性粒細胞數目逐漸增多（圖2b），說明中性粒細胞在吞噬載藥納米顆粒后并不影響其趨向炎癥遷移特性。接著，研究人員在小鼠體內建立膠質瘤術后模型，利用T2加權的MRI技術觀察細胞藥物輸運體系靶向術后腫瘤炎癥區域的遷移情況。結果顯示，與單純的載藥納米顆粒相比，細胞藥物輸運體系在術后膠質瘤區域顯示增強的T2-MRI信號（圖2c），在靜脈注射2h后腫瘤部位相對磁共振信號強度下降超過30%（圖2d）。進一步對術后荷瘤小鼠大腦進行切片及普魯士藍染色，發現細胞藥物輸運體系在殘余腦腫瘤區域有大量鐵的沉積（圖2e），證實中性粒細胞可以有效地將載藥納米顆粒運輸到炎癥腦腫瘤組織，并可通過MRI進行體內載藥中性粒細胞的示蹤。

圖2：a）體外炎癥趨化示意圖；b）細胞藥物輸運體系向Transwell下室的遷移情況；c）術后膠質瘤小鼠靜脈注射前后的體內T2-MRI圖；d）術后膠質瘤部位相對信號強度隨時間變化圖；e）腦腫瘤組織普魯士藍染色組織學分析圖。

　　為了研究藥物是如何從中性粒細胞釋放進而發揮作用，研究人員將腦膠質瘤細胞鋪在共聚焦顯微鏡專用的培養皿上，然后與細胞藥物輸運體系共孵育2h后，發現有大量NETs的形成，同時可見熒光標記的納米顆粒存在于中性粒細胞形成的誘捕網中（圖3a, b）。進一步延長孵育時間到4h，可在腫瘤細胞核周圍觀察到納米顆粒的存在（圖3c）。這些結果表明，載藥納米顆粒隨著NETs的形成，可從中性粒細胞釋放并被腫瘤細胞吞噬。

圖3：膠質瘤細胞與細胞藥物輸運體系共培養a, b）2h和c）4h后的共聚焦圖像。

　　為了進一步考察該 “特洛伊木馬”在體內的療效，研究人員通過建立不完全切除的腦膠質瘤模型來模擬術后腦膠質瘤復發。結果發現，細胞藥物輸運體系具有最強的抑制腫瘤復發的效果，并顯著延長術后荷瘤小鼠生存期。此外，研究人員還通過流式細胞儀進一步分析了治療兩天后腫瘤組織中殘余腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞的水平與活性狀態，發現細胞藥物輸運體系處理組中腫瘤細胞占比出現明顯下降，且檢測到的腫瘤細胞凋亡比例高達21%（圖4a-c）。對腫瘤組織中的腫瘤相關巨噬細胞（CD11b+CD45+）分析也發現，處理組中的中性粒細胞（CD11b+CD45HiLy6CHiLy6G+）較對照組提高了7.61倍，而巨噬細胞（CD11b+CD45HiLy6CLoLy6G-）的數量則大大減少，死亡比例也顯著增加（圖4d, e）。這些結果表明中性粒細胞不僅可以攜帶載藥納米顆粒到達術后腦膠質瘤區域，釋放藥物直接殺死腫瘤細胞，還可以誘導腫瘤組織中巨噬細胞的死亡，實現神奇的“特洛伊木馬”效應。

圖4：術后腦膠質瘤治療機制。a-c）流式細胞儀檢測腫瘤細胞占比和死亡比例；d, e）細胞藥物輸運體系處理組術后殘余腫瘤中腫瘤相關巨噬細胞的占比和死亡比例。