狙擊艾滋病毒――“引蛇出洞”還是“關門打狗”？

　　曾慶平

　　有很多非專業或跨專業人士對于人類為何數十年攻克不了艾滋病難題感到迷惑不解，那是因為他們不太了解艾滋病毒致病的“特洛伊木馬”機制。

　　艾滋病毒之所以能“摧毀”人類的免疫系統，是因為它們專門感染并殺死免疫細胞。不過，只要它們在免疫細胞內復制并產生新的病毒，人體都能立即識別它們并設法圍殲之，如體液免疫(抗體)和細胞免疫(細胞因子)。

　　可惡的是，有些病毒進入免疫細胞后并不復制，而是藏匿起來等待時機，一旦時機成熟，它們就會從“木馬”中蘇醒過來并發起瘋狂反撲，直到逐漸摧毀人體的免疫系統，最后將人置于死地。

　　那么，病毒為何如此聰明，竟然知道見機行事呢?其實，并不是它們有多聰明，只不過它們因為“誤入”靜息淋巴細胞而沒有辦法繁殖后代，只有等到靜息淋巴細胞被激活成活躍淋巴細胞后，它們才能“傾巢而出”搞破壞。

　　艾滋病之所以難治，是因為潛伏病毒惹的禍!現在艾滋病患者服用的抗艾滋病毒藥物(蛋白酶抑制劑和逆轉錄酶抑制劑)都可以殺死血液中的游離病毒，但對靜息淋巴細胞中的潛伏病毒卻無能為力!

　　正如自然界中某些生物特有的“假死”本能一樣，只要獵物一動不動，獵食者就難以發現它們。獵食者唯一能做的就是“守株待兔”——小樣，你總不可能一直裝死吧!最后的勝利者究竟是誰，要看誰有足夠的耐性!

　　人體依賴免疫細胞剿滅艾滋病毒，最初敵我雙方勢均力敵，你生產多少病毒，我都可以全部殺死。但是，不幸的是，艾滋病毒在潛伏過程中經過“喬裝打扮”(基因突變)一番后，就能躲過免疫衛士的視線而逃之夭夭，進而重新為非作歹。

　　因此，要把隱患消滅在萌芽狀態之中，可以采取兩種策略，一種是在潛伏病毒還來不及“偽裝”之前就把它們攆出來“斬首”，可以形象地稱之為“引蛇出洞”策略;另一種是把房門緊鎖并用鐵鏈套住不讓它們出門搗亂，可以形象地稱之為“關門打狗”策略。

　　前一個策略已經用過多年，一般是使用淋巴細胞激活劑，在使淋巴細胞被激活的同時，也能激活潛伏病毒，再用藥物殺滅活化的病毒。可是，現在看來，這種貌似可以根除潛伏病毒的策略并不像預期的那樣有效，究其原因可能是因為被激活的病毒還可能感染新的靜息淋巴細胞。

　　最近《每日科學》(Science Daily)登載了兩篇關于激活艾滋病毒的科普文章，有興趣的讀者可以讀一讀，特別建議學化學及從事新藥研發的人看看：

　　Closer to a Cure? Chemists Synthesize Compound That Flushes out Latent HIV

　　(http://www.sciencedaily.com/releases/2012/07/120717141233.htm)

　　New Approach To Targeting The Hidden Reservoir Of HIV

　　(http://www.sciencedaily.com/releases/2009/10/091001181041.htm)

　　后一個策略還很少應用，最早時有人設想使用甲基化試劑封閉艾滋病毒的轉錄起始區，但由于一直找不到特異性甲基化修飾劑而無法實施。因此，如果誰能將艾滋病毒永久鈍化在淋巴細胞內，誰就有可能最終制伏艾滋病。

　　我們想到了一個“妙計”，準備在這里拿出來獻獻丑，非專業人士可能看不懂，但它或許能給專業人士提供一點啟發，起到拋磚引玉的作用。

　　【摘要】

　　高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)只能降低人免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)感染者的血液病毒載量，HAART配合病毒活化方案也無法清除潛伏病毒，因此有必要及時調整抗HIV-1感染及艾滋病治療策略。HIV-1感染CD4+T細胞后轉變成CD4+T記憶細胞或病毒基因組整合到靜息CD4+T細胞染色體是病毒潛伏的必要條件，轉錄因子缺乏和病毒基因不能轉錄則是病毒潛伏的根本原因。為了模擬HIV-1潛伏的細胞環境，我們擬利用 RANTES/SDF-1和抗CD45RA/CD45RO抗體偶聯基因藥物，經Ex vivo導入HAART治療的艾滋病猴體內，通過結合CCR5/CXCR4和CD45RA/CD45RO靶向導入靜息CD4+T細胞。通過LTR基因敲除抑制病毒復制、反義IL-7R RNA阻斷潛伏感染細胞增殖、Tat結合LTR誘導活化感染細胞自殺等“多保險”策略，永久鈍化潛伏病毒，減少病毒復制傳播，甚至清除潛伏病毒庫，以便為艾滋病患者提供新的HAART補充療法。

　　【全文】

　　艾滋病(AIDS)是一種主要由人類免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)感染所引起的致命性傳染病。雖然經過近30年的研究早已闡明艾滋病的發病機理，但至今仍未能徹底征服它，成為嚴重危害人類健康和生命的重大疾病。2009年11月24日，聯合國艾滋病規劃署在上海公布《2009年艾滋病流行報告》和《2010年艾滋病防治前景展望》，根據最新數據顯示，艾滋病流行至今，全球大約已有6000萬人感染了HIV-1，2500萬人死于艾滋病相關疾病。 2008年，全球估計有156億美元用于艾滋病的防治。聯合國艾滋病規劃署估計，2010年這一需求將上升至250億美元。

　　2008年9月，默克公司聯手美國過敏與傳染病研究所主持的艾滋病疫苗實驗宣告失敗，諾貝爾醫學獎獲得者、著名艾滋病專家David Baltimore在美國科學促進會年會上致辭時指出：“基于HIV-1復雜的變異性，研究者們至少在25年或30年之內不可能找出有效的、適用于人類的艾滋病疫苗來，甚至人類可能永遠也找不到這種疫苗”。盡管這種觀點過于悲觀，但預示著艾滋病疫苗的研制工作及臨床應用任重而道遠。2009年9月26日，美國-泰國艾滋病疫苗合作研發小組宣布，他們研制的艾滋病疫苗能讓接種者的感染風險降低31.2%。臨床試驗結果顯示，該疫苗接種后并未追蹤到抗HIV- 1抗體以及識別并殺滅HIV-1的T細胞。實際上，在51名接種疫苗后感染HIV-1的志愿者體內，病毒的繁殖程度與未接種者幾乎沒有區別。世界衛生組織和聯合國艾滋病規劃署發表聲明表示，作為有效疫苗應該至少能將感染風險降低50%以上，僅僅基于目前的試驗結果，還不能批準生產這種疫苗。

　　可喜的是，相對于艾滋病疫苗的艱辛歷程，艾滋病的藥物治療已經取得很大進展。自從美國洛克菲勒大學艾倫戴蒙德艾滋病研究中心行政總裁、清華大學艾滋病綜合研究中心主任、美籍華裔學者何大一(David Ho)于1996年首創“雞尾酒療法”即現在的“高效抗逆轉錄病毒療法”(HAART)以來，已利用17種逆轉錄酶抑制劑(包括13種核苷類逆轉錄酶抑制劑及4種非核苷類逆轉錄酶抑制劑)和11種蛋白酶抑制劑的選擇性組合給藥方案，通過選擇性抑制病毒生活史的不同階段(侵入、逆轉錄、整合、成熟)，可以讓大部分HIV-1感染者不再出現病毒血癥，艾滋病患者的死亡率降低了60%-80%。由于接受抗病毒治療后患者生命得以延長，加上人口數量的增長，目前 HIV-1感染者的數量比以往更多，然而因為更多人獲得了治療，艾滋病相關疾病的死亡人數在過去5年里下降了10%以上。聯合國艾滋病規劃署和世界衛生組織估計，自1996年HAART治療方案問世以來，挽救了大約290萬人的生命。

　　正當人們慶幸艾滋病可能被徹底征服的時代即將來臨之際，美國約翰霍普金斯大學醫學院霍華德休斯醫學研究所的著名艾滋病專家Robert F. Siliciano在Nature Medicine撰文指出，盡管HAART能使HIV-1感染者體內的病毒載量降低到檢測閾值以下(即<50拷貝/細胞)，但卻不能完全殺滅靜息 CD4+T細胞中的整合原病毒(Siliciano et al. 2003)。HAART治療期間可見4種動態病毒血癥：(1)高速清除期：HIV-1感染的活化CD4+T細胞的清除，此類細胞的半衰期僅為1天;(2)中速清除期：HIV-1感染的巨噬細胞、部分活化的CD4+T細胞和濾泡樹突狀細胞(FDC)的清除，此類細胞的半衰期約為1-4周;(3)慢速清除期：半衰期約為39周的其他HIV-1感染細胞的清除;(4)穩定期：HIV-1在靜息CD4+T細胞中穩定保持而不能被清除。據測算，靜息CD4+T細胞的半衰期在44個月以上，人體中這類細胞的總數約為100萬個，從HIV-1感染者體內完全清除病毒庫的時間長達60-70年(Geeraert et al. 2008)。這就意味著HIV-1感染者將終身攜帶病毒，因而必須終身服藥，這給病人、家庭和社會造成沉重的經濟負擔，而藥物導致的嚴重副作用可能迫使患者中途放棄藥物治療。更令人擔憂的是，在服藥期間病毒發生抗藥性突變后，患者將面臨無藥可救的致命后果。

　　毋庸置疑，全世界的科學家們都已經清醒地認識到，靜息CD4+T細胞中潛伏病毒的存在就是艾滋病無法治愈的關鍵所在!為了清除潛伏病毒庫，人們提出了各種各樣的治療方案，最初提出的方案是利用T細胞激活劑(如IL-6 + IL-2 + TNF-α、IL-2 + 抗CD3單克隆抗體OKT3等)使攜帶整合原病毒的靜息CD4+T細胞激活，同時配合HAART清除產生活化病毒的CD4+T細胞。可是，臨床試驗結果表明，T細胞激活聯合HAART并不能清空病毒庫，停藥2-3周后病毒就立刻出現反彈。同時，T細胞的非特異性激活還給志愿者帶來嚴重副作用，甚至出現短暫失明和心臟病突發等危急狀況(Margolis and Archin 2006)，迫使研究者不得不考慮只激活病毒而不激活T細胞的新方案(Siliciano et al. 2007)。為此，先后有人嘗試用蛋白激酶C(PKC)拮抗劑、組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)抑制劑等進行臨床試驗(Reuse et al. 2009)。可是，幾年過去了，各種治療方案都未在臨床上取得實際療效。有人斷言，現有方法不可能清除HIV-1感染者體內的潛伏病毒(Marcello 2006)。

　　為什么病毒活化配合HAART仍不能清除潛伏病毒庫呢?最近在J. Virol上發表的1篇最新文章也許為回答這個問題提供了新線索。該論文證實，HIV-1不僅可以生產性感染激活的CD4+T細胞，而且病毒基因組還能直接整合到靜息CD4+T幼稚細胞和記憶細胞染色體上，盡管它們在幼稚細胞中的整合效率遠低于記憶細胞(Dai et al. 2009)。于是，經過病毒活化處理后，大量子代病毒將從感染細胞中釋放出來，又造成更多靜息CD4+T細胞感染，再加上一部分病毒感染的CD4+T細胞轉變成攜帶整合原病毒的CD4+T記憶細胞，從而造成潛伏-活化-感染-再潛伏的惡性循環。其次，全身非特異性給藥也可能是重要原因之一，因為靜息 CD4+T細胞的數目非常少(100萬個)，而攜帶潛伏病毒的靜息CD4+T細胞更少(淋巴結內僅有5/100萬，血液中僅有7/100萬)，非靶向給藥顯然難以讓如此稀少的病毒潛伏細胞攝取到足以殺滅病毒感染細胞的藥物濃度。此外，某些表觀基因治療藥物在激活病毒的同時，也可引起諸多副作用，如PKC拮抗劑阻斷正常細胞的轉錄因子信號轉導、HDAC抑制劑影響所有基因的正常功能、DNMT抑制劑促進原癌基因表達等，都會使潛伏病毒庫的機體免疫及化學藥物清除復雜化。

　　既然病毒活化策略不能奏效，那么是否可以考慮抑制整合病毒的活化呢?實際上，潛伏感染就是病毒在特定時空環境中的一種鈍化形式，只不過鈍化周期很短，一旦細胞被激活，原病毒基因便開始表達，新的子代病毒也將產生出來。如果能夠模擬病毒潛伏的條件，讓整合病毒基因組在染色體上永久沉默，就能使病毒潛伏感染細胞不再出現生產性感染直至死亡。國際人類基因組測序團隊(IHGSC)早期發表的研究報告指出，從人類基因組的進化史來看，失活的轉座子和病毒作為“進化遺跡”其實大量存在于現代人類基因組中，而且很多人類基因都是從這些外來基因進化而來的(IHGSC, 2001)。有趣的是，剛剛在Nature雜志上發表的一篇最新報道宣稱，人類8%的遺傳物質來自Borna病毒，暗示病毒基因組可以通過所謂“內生化” 過程被人類基因組“同化”(Feschotte 2010)。

　　為了人工鈍化HIV-1，應當了解病毒潛伏的機理以及病毒活化的誘導因素。過去一直懷疑HIV-1長末端重復(LTR)上CpG島的甲基化修飾可能是導致病毒潛伏的原因，因為類似的相關性在人T細胞白血病病毒1型、Moloney鼠白血病毒、勞斯肉瘤病毒、人內源性逆轉錄病毒H、K、W家族等逆轉錄病毒感染中已有報道。可是，2009年8月由法國、美國、比利時和捷克科學家組成的研究團隊在PLoS ONE上發表文章指出，LTR中CpG島的高度甲基化并不能阻止HDAC抑制劑(NaBut、TSA、SAHA、apicidin)、PKC拮抗劑(PMA、prostratin)、細胞因子(TNF-α)和DNMT抑制劑(5-aza-dC、zebularine)誘導的病毒活化(Blazkova et al. 2009)，但LTR甲基化可能負責病毒潛伏的維持而不是建立。在HIV-1長期感染的U937細胞和潛伏感染的ACH-2細胞系中，CpG甲基化的確被認為是病毒潛伏的維持機理(Kauder et al. 2009)。由于HIV-1基因組突變頻繁，宿主細胞對病毒基因組的主動甲基化造成的堿基錯配并不能阻止病毒繁殖。因此，DNA甲基化可能是人體抵抗 HIV-1感染的失敗防御機制之一。

　　限制性染色質的形成也被認為是病毒潛伏的另一個可能原因，因為HIV-1進入潛伏狀態需要HDAC-1、組蛋白甲基轉移酶HMTSuv39H1和異染色質蛋白HP-1結合到LTR所在的染色質上。然而，有人反駁說，HIV-1感染者的靜息CD4+T記憶細胞中整合的原病毒90%以上都位于表達活躍的基因中，不太可能形成抑制病毒轉錄的所謂“組蛋白密碼”(Han et al. 2004)。2009年，美國阿拉巴馬大學的研究人員在J Virol上發表文章認為，組蛋白去乙酰化和DNA甲基化等表觀遺傳控制模式對于病毒潛伏狀態的建立都不重要，因為HDAC抑制劑或DNMT抑制劑并不能阻止病毒潛伏(Duverger et al. 2009)。

　　另外，還有其他因素也可能促進HIV-1潛伏。Huang et al. (2007)在Nature發表文章指出，靜息CD4+T細胞中miRNA(miR28、miR125b、miR150、miR223、miR382)的豐度顯著高于CD4+T細胞，表明細胞miRNA可能通過RNAi促進病毒潛伏狀態的建立或維持。Chiu et al.(2005)在Nature上報道，靜息CD4+T細胞可通過APOBEC3G(A3G)蛋白的作用阻斷HIV-1感染，而T細胞激活能消除A3G 對HIV-1感染的抑制作用。不過，PLoS ONE發表的最新研究結果卻得出否定的結論，即敲除A3G基因的靜息CD4+T細胞仍能抵抗HIV-1感染(Santoni and Trono 2009)。

　　2009年12月，比利時自由布魯塞爾大學的研究人員在Retrovirology發表綜述，將HIV-1潛伏區分為整合前潛伏和整合后潛伏2大類型，并總結了導致整合后潛伏的5種可能因素：(1)整合位點，包括空間位阻、啟動子沖突和增強子陷阱;(2)感染細胞中轉錄因子的豐度;(3)啟動子上染色質的組成;(4)病毒Tat蛋白及Tat結合因子;(5)miRNA與RNAi(Colin and Van Lint 2009)。由此可見，病毒潛伏是一個受多因素影響的過程，涉及到病毒與感染細胞之間復雜的相互作用。但是，導致病毒潛伏的核心因素還是病毒基因表達受阻，即病毒是否潛伏取決于病毒感染發生時宿主細胞中轉錄活性的高低，病毒進入轉錄因子缺乏的靜息CD4+T幼稚細胞及記憶細胞或者病毒感染的CD4+T細胞部分轉變成靜息CD4+T記憶細胞，導致病毒反式活化蛋白Tat不能合成，于是病毒進入潛伏狀態。

　　為了阻斷HIV-1基因表達，首先應防止病毒“盜用”宿主細胞轉錄因子。NF-kB是激活HIV-1基因表達的主要轉錄因子，它在未激活的病毒感染細胞中通常與抑制性亞基IkB結合而滯留在細胞質中。當病毒感染細胞被激活后，NF-kB就從IkB分離出來并轉位到細胞核內，通過結合病毒LTR區U3核心增強子中2個保守的kB位點啟動病毒基因表達。澳大利亞研究人員曾嘗試用21個核苷酸的siRNA靶向作用于HIV-1LTR的NF-kB結合位點，結果使慢性感染MAGIC-5細胞的生產性感染長時間受到抑制(至少30天)(Suzuki et al. 2005)。不過，由于HIV-1的高度變異性，利用siRNA結合LTR阻斷病毒復制存在很大風險。一旦LTR的NF-kB位點發生堿基突變，siRNA的抑制作用就會立即失效，除非重新針對突變靶點設計新的siRNA(Rossi 2006)。

　　于是，NF-kB抑制劑便成為阻斷病毒復制的重要選項之一。最經典的NF-kB抑制劑是吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)。最近報道，藥用植物肉桂中的苯酸鈉也能抑制NF-kB活性(Brahmachari et al. 2009)。我國科學家不久前發現，青蒿琥酯可通過抑制NF-kB活性及PI3激酶/Akt信號轉導途徑阻斷TNF-α誘導的促炎癥細胞因子(IL-1、 IL-6、IL-8)合成(Xu et al. 2007)。眾所周知，青蒿素及其衍生物(青蒿琥酯、雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等)是非常有效的抗瘧藥，但它們能否通過抑制NF-kB活性阻斷HIV- 1復制尚未見報道。

　　在利用NF-kB抑制劑之前必須先解決以下2個問題：①NF-kB并不是HIV-1依賴的唯一轉錄因子。Robert F. Siliciano所在的研究小組最近在PNAS發表論文指出，潛伏病毒活化除涉及NF-kB轉錄因子依賴途徑外，還涉及Ets-1轉錄因子異位剪接分子(ΔVII-Ets-1)依賴途徑(Yang et al. 2009)。實際上，根據以往的研究結果，HIV-1可利用通用轉錄因子(Sp1、TFIID等)和誘導轉錄因子(NF-kB、NFAT、AP-1等)啟動基因轉錄。因此，僅僅采用某種特異性轉錄因子抑制劑不可能完全阻斷HIV-1復制。②轉錄因子也是宿主細胞中正常基因表達所必需的，如NF-kB在調節機體免疫反應中具有重要作用，若正常細胞中轉錄因子合成受阻或活性被抑制都將導致細胞功能異常甚至致死。

　　另一方面，HIV-1的Tat蛋白可通過激活轉錄延伸過程促進全長病毒基因組的合成，由LTR開始轉錄產生大約100個核苷酸后，Tat便結合上來，從而大大提高轉錄效率(至少1000倍)。因此，Tat蛋白合成的抑制也是阻斷病毒基因表達的重要環節之一。Hoffmann-La Rothe公司是Tat抑制劑研發的先驅。1991年該公司科研人員在Science上發表文章, 首次報道苯二氮類化合物Ro5-3335和Ro24-7429可抑制Tat介導HIV-1的反式激活，其中Ro24-7429還曾進入I期臨床試驗，但后因療效不理想并且有神經毒性而中途放棄。最近，澳大利亞的研究人員在PLoS ONE報道，一種突變型Tat蛋白——Nallbasic能同時抑制反式激活、Rev依賴的mRNA轉運和逆轉錄，從而阻斷HIV-1的復制(Meredith et al. 2009)。

　　最近，法國科學家研究發現，中心T記憶細胞(TCM)和T過渡細胞(TTM)是HIV-1感染者體內主要的潛伏病毒庫，通過白細胞介素-7(IL-7)及低水平抗原刺激的T細胞增殖，潛伏病毒可以長期存在于HIV-1感染者體內(Chomont et al. 2009)。葛蘭素史克(上海)研發中心的研究人員最近在Nature Medicine發表的論文指出，IL-7受體(IL-7R)拮抗可抑制JAK-ATAT5信號轉導途徑，并改變促存活蛋白Bcl2與促凋亡蛋白Bax的表達模式(Liu et al. 2010)。因此，可選擇IL-7R siRNA、IL-7R反義RNA或JAK抑制劑阻斷HIV-1感染T細胞的增殖。

　　根據上述研究結果，我們擬將艾滋病治療策略由病毒活化配合HAART治療調整為先用HAART消除病毒血癥，留下僅含有整合原病毒的靜息CD4+T細胞，然后通過基因治療使靜息CD4+T細胞中的原病毒永久鈍化。為此，本項目將首先利用SIVmac251毒株感染的CEMx174細胞系評價基因治療藥物及其組合物強制鈍化整合原病毒的效果。體外研究的具體內容包括：(1)構建LTR基因打靶及IL-7R反義RNA表達載體，完全敲除整合原病毒的LTR序列，杜絕病毒復制及基因轉錄，并抑制IL-7與IL-7R的相互作用，阻斷感染的靜息CD4+T細胞活化與增殖;(2)建立Tat誘導的自殺基因表達系統，防止新病毒感染造成的原病毒重組復活。

　　基因打靶/IL-7R反義基因表達載體由SIV LTR左側序列-CMV啟動子-IL-7R反義基因-SIV LTR右側序列組成，此外還含有病毒包裝識別序列φ和RRE序列，其中LTR的左、右側序列可通過雙交換替換病毒LTR，將CMV啟動子-IL-7R 反義基因整合在LTR所在的位置。在CMV啟動子驅動下，該嵌合基因可轉錄生成IL-7R 反義RNA，抑制IL-7介導的整合SIV靜息CD4+T細胞分裂與增殖，防止病毒在細胞間逐代傳播。即使基因打靶/IL-7R反義基因表達載體被導入非感染的CD4+T細胞，由于無同源序列而不會發生基因重組，因此不會抑制正常CD4+T細胞的分裂，可以起到選擇性增殖抑制作用。

　　Tat誘導自殺基因表達系統由Tat誘導表達載體和前藥共同組成。Tat誘導自殺基因表達載體含有SIV LTR序列控制的細胞色素c(Cytc)cDNA;前藥包括亞麻酸和雙氫青蒿酸(DHAA)。Tat誘導合成的Cytc可催化亞麻酸釋放單線態氧(1O2)(Koga et al. 1991)，1O2可促進DHAA轉變成青蒿素(Guo et al. 2010)，青蒿素則通過多種機制(包括抑制NF-kB活性)誘導細胞凋亡。在前期研究中，我們用10μM青蒿琥酯和相同濃度的DHAA分別處理 SIVmac251感染的CEMx174細胞，經過48h孵育后，青蒿琥酯共培養細胞在未出現病變以前就全部死亡，而DHAA共培養細胞繼續生長并產生病變。

　　在非感染的CD4+T細胞及未被激活的靜息CD4+T細胞中，自殺基因中從LTR開始的基礎轉錄受到負轉錄延伸因子(N-TEF)包括負延伸因子(NELF)及DRB敏感性誘導因子的抑制。因此，LTR控制的cytc基因不表達，DHAA不能轉變成青蒿素，細胞正常生長。相反，在病毒生產感染細胞中，LTR在Tat誘導下可募集正轉錄延伸因子(P-TEF-b)到啟動子上解除N-TEF對轉錄延伸的抑制(Unwalla et al. 2006)。cytc基因表達合成Cytc，催化1O2釋放及青蒿素生成，導致細胞凋亡。

　　在體內實驗中，如何將上述基因治療藥物靶向導入HIV- 1感染的CD4+T細胞以及HIV-1潛伏的靜息CD4+T細胞呢?HIV-1主要感染CD4+細胞(T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等)，病毒侵入 CD4+細胞主要依賴CD4，同時還要借助各種輔助受體，其中巨噬細胞嗜性病毒依賴CCR5受體，而T細胞嗜性病毒依賴CXCR4受體。T細胞表面還表達蛋白質酪氨酸磷酸酶受體C(PTPRC)即CD45抗原，其中CD45RA特異表達在幼稚T細胞表面，CD45RO特異表達在記憶T細胞表面。如果利用 CCR5/CXCR4的天然配基RANTES/SDF-1偶聯化學藥物或基因治療藥物，就能通過受體-配基相互作用將藥物靶向導入T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。若用抗CD45RA/CD45RO抗體偶聯藥物，則可通過抗原-抗體相互作用將藥物靶向導入靜息CD4+T細胞。但是，目前尚未見趨化因子或抗 CD抗體作為藥物載體治療艾滋病的報道。早前曾經報道，人乳頭瘤病毒-16(HPV16)L1抗原基因(Kim et al. 2003)及流感病毒血凝素基因(Williman et al. 2008)與RANTES基因融合曾被用來增強DNA疫苗的免疫原性;胞內趨化因子(intrakine)RANTES基因表達(Yang et al. 1998)或抗CCR5胞內抗體(intrabody)基因表達(Swan et al. 2005)可下調細胞表面CCR5/CXCR4密度，從而抑制HIV-1進入感染細胞。

　　利用趨化因子偶聯大分子藥物(如蛋白質或核酸)的困難之一是所制備的復合物分子量巨大，在體內可能被各種組織吸附而很難到達靶點部位。因此，我們擬放棄采用通常的“體外直接偶聯法”，建立“體內自動偶聯法”。這種方法是分別構建“彈頭藥物”和導向分子的基因表達載體，通過生物素與親和素的結合而使“彈頭藥物”與導向分子自動偶聯，其中“彈頭藥物”是用PCR添加生物素標記尿苷酸的基因打靶/IL-7R反義基因表達載體和Tat誘導自殺基因表達載體，導向分子為親和素基因-RANTES/SDF-1基因融合表達載體。采用基因治療中常用的Ex vivo技術將上述基因治療藥物離體導入猴外周血CD4+T細胞并回輸猴體內后，細胞內基因表達系統合成并釋放的生物素標記基因表達載體就與親和素 -RANTES/SDF-1自動結合。這種方法的最大優點是給藥時只是將分子量較小的質粒DNA離體轉染到CD4+T細胞中，而不是導入分子量巨大的超分子蛋白質復合物。同時，利用感染細胞的裂解特性，還能將這種“假病毒”被包裝后不斷“感染”新的CD4+T細胞。

　　至于2種前藥的靶向給藥，我們將仿照“抗體導向酶前藥療法”(ADEPT)的原理，建立“CD45RA/ CD45RO抗體偶聯亞麻酸及DHAA酶前藥療法”。抗體與小分子前藥的連接采用碳化二亞胺偶聯法。碳化二亞胺是一種化學性質非常活躍的雙功能試劑，它們既可與半抗原上的羧基又可與半抗原上的氨基縮合。此法非常簡便，只要將半抗原與載體蛋白質按一定分子比混合在適當的溶液中，然后加入碳化二亞胺，攪拌l- 2h，置室溫反應24h，最后透析除去未反應的半抗原，即可得到人工免疫原。

　　可以預見，基因敲除/IL-7R反義RNA靶向靜息CD4+T細胞鈍化潛伏病毒，Tat誘導LTR-cytc嵌合基因靶向清除病毒活化CD4+T細胞。整合病毒基因組中LTR基因敲除可確保病毒不能轉錄和復制;IL-7R基因反義抑制可阻斷IL-7誘導靜息CD4+T細胞增殖。一旦外來病毒與整合病毒重組，病毒基因將重新表達，由此產生的Tat可活化無細胞毒性的青蒿素前體產生有細胞毒性的青蒿素，導致病毒感染細胞死亡，杜絕病毒在體內的擴散。

　　本項目提出的艾滋病靶向基因治療“多重保險”策略，目前國內外均未見報道。它是在HAART消除病毒血癥的基礎上，通過靶向靜息CD4+T細胞鈍化潛伏病毒及清除潛伏病毒活化的CD4+T細胞。如果該研究方案的可行性得到初步證實，那么將為艾滋病治療方案的制定提供新的思維。當前，在清除潛伏病毒庫的嘗試遭遇困難之際，通過調整思路，改變策略，以“病毒鈍化”代替“病毒活化”，也許可以為化解艾滋病治療的困局找到一個突破口，同時還可能為無病毒血癥的 HIV-1攜帶者提供一種輔助HAART的新療法。