實時熒光定量PCR

Real Time PCR

實時熒光定量PCR

　　其定量的基本原理是在 PCR 反應體系中加入非特異性的熒光染料（如： SYBR GREEN I ）或特異性的熒光探針（如： Taqman 探針），實時檢測熒光量的變化，獲得不同樣品達到一定的熒光信號（閾值）時所需的循環次數： CT 值（ Cycle Threshold ）；通過將已知濃度標準品的 CT 值與其濃度的對數繪制標準曲線，就可以準確定量樣品的濃度。熒光定量 PCR 技術具有簡便、快捷的優點，能夠有效擴增低拷貝的靶片段 DNA ，對每克樣品中 20pg-10ng 的轉基因成分進行有效檢測。同時，與 Southern 法相比，熒光定量 PCR 技術可對 T-DNA 的不同序列進行擴增，因此能實現對轉基因品系中的基因重組的檢測（ Giovanna 2002 ）。 

    所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在 實時熒光定量PCR技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發現，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉 的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運用。

PCR每進行一個循環，DNA呈2倍的指數關系增長，不久達到平臺期，起始DNA量越多擴增產物量便越早達到檢出值，也就 是擴增曲線越早起峰，我們將已知濃度的標準品梯度稀釋進行real time PCR，就會按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線，再有Ct值與起始模板數的對數值之間存在的線性關系就可以制作成下圖所示的標準曲 線。未知濃度的樣品與標準品相同，也可以得到Ct值，并將Ct值帶入標準曲線，就可以求出未知濃度樣品的起始模板量，這就是real time PCR的定量原理。

real-time PCR 掃盲文章

多聚酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）技術發明至今已近20年了，在這期間技術得到了不斷的發展，近年來出現的實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR）技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點成為了分子生物學研究中的重要工 具，本文就此技術及其應用做一綜述。

1 實時熒光定量PCR技術的方法學

1.1 原理 所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在 real-time 技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發現，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉 的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運用。

PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加，最終PCR反應不再以指數方式生成模板， 從而進入平臺期。在傳統的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應的最終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。在 real-time Q-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲 線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點 上來檢測PCR產物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-time Q-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號 （baseline），熒光域值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義 樣本的域值循環數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的 對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣 品的起始拷貝數。

1.2 熒光化學 目前real-time Q-PCR所使用的熒光化學方法主要有五種，分別是：DNA結合染色，水解探針，分子信標，熒光標記引物，雜交探針。它們又可分為擴增序列特異和非特異的檢測兩大類。

擴增序列非特異性檢測方法的基礎是DNA結合的熒光分子，如SYBR green 1等熒光染料。Real-time Q-PCR發展早期就是運用這種最簡單的方法，在PCR反應體系中，加入過量SYBR green 1熒光染料，SYBR green 1熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號。熒光染料的優勢在于它能監測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時 也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結合，使實驗容易產生假陽性信號。引 物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決。

擴增序列特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物，它又可分為直接法和間接法。 間接的方法就是利用水解探針的策略。目前在real-time Q-PCR中最廣泛使用的TaqMan系統就是運用了這個原理。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分 別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，此時5′端熒光基團吸收能量后將能量轉移給臨近的3′端熒光淬滅基團（發生熒光共振能量轉移，FRET），因 此探針完整時，檢測不到該探針5′端熒光基團發出的熒光。但在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結合。在引物的介導下， 沿模板向前延伸至探針結合處，發生鏈的置換，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基 團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現 了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

直接的方法指的是標記熒光的探針與擴增產物結合后即直接產生熒光，分子信標（molecular beacon）就屬于這一類，它本質上是一種標記熒光的發夾探針，當探針分子呈發夾結構時，結合在其兩端的熒光基團距離上接近，使得產生能量轉移效應，而 不發生熒光。當互補序列出現時，探針與DNA雜交，探針轉變成一個開放的結構，呈線性，報告熒光基團與淬滅熒光基團彼此在空間上產生足夠的分離，熒光基團 脫離了淬滅基團的影響，從而產生可被檢測到的熒光。熒光標記引物是從分子信標的概念變化而產生的一種聯合分子探針系統，它把熒光基團標記的發夾結構的序列 直接與PCR引物相結合，從而使熒光標記基團直接摻入PCR擴增產物中。目前主要有兩種：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。雜交探針（hybridization probe）使用兩個特異的探針，其中上游的探針的3′端標記有供體熒光素（donor），而下游的探針的5′端標記有受體熒光素（acceptor）。 在PCR中模板退火階段，兩探針同時與擴增產物雜交，并形成頭尾結合的形式，使供體和受體熒光素距離非常接近，兩者產生熒光共振能量轉移（FRET，此作 用與上述水解探針的方式相反），使得受體熒光基團發出熒光；當兩探針處于游離狀態時，無熒光產生。由于反應中運用了兩個探針，因此增加了方法的特異性，另 外也可利用熒光寡核苷酸熔解曲線（melting curve）對與寡核苷酸探針結合的序列進行分析，從中獲取有用的信息。

1.3 定量方法 在real-time Q-PCR中，模板定量有兩種策略；相對定量和絕對定量。相對定量指的是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化。絕對定量指的是用已知的標準曲線來推算未知的樣本的量。

1.3.1 標準曲線的法的相對定量 由于在此方法中量的表達是相對于某個參照物的量而言的，因此相對定量的標準曲線就比較容易制備，對于所用的標準品只要知道其相對稀釋度即可。在整個實驗中 樣本的靶序列的量來自于標準曲線，最終必須除以參照物的量，即參照物是1*的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。在實驗中為了標準化加入反應體系的RNA 或DNA的量，往往在反應中同時擴增一內源控制物，如在基因表達研究中，內源控制物常為一些管家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脫氫酶 GAPDH等）。

1.3.2 比較CT法的相對定量 比較CT法與標準曲線法的相對定量的不同之處于在于其運用了數學公式來計算相對量，前提是假設每個循環增加一倍的產物數量，在PCR反應的指數期得到CT 值來反應起始模板的量，一個循環（CT=1）的不同相當于起始模板數2倍的差異。但是此方法是以靶基因和內源控制物的擴增效率基本一致為前提的，效率的偏 移將影響實際拷貝數的估計。

1.3.3 標準曲線法的絕對定量 此方法與標準曲線法的相對定量的不同之處在于其標準品的量是預先可知的。質粒DNA和體外轉入的RNA常作為絕對定量標準品的制備之用。標準品的量可根據260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來轉換成其拷貝數來確定。

2 實時熒光定量PCR技術的應用

Ｒeal-time Q-PCR的應用范圍很廣泛，包括mRNA