毛細管電泳―ICPMS聯用測定海藻中鉛形態化合物

　　1引言 
　　鉛元素分布廣泛，能夠在生物體內蓄積且排除緩慢，生物半衰期長，是具有高毒性的重金屬環境污染物[1，2＼]；長期攝入微量鉛化合物，會對神經系統、消化系統、生殖系統和造血系統等多個系統造成損傷，具有一定致突變效應和致癌性。隨著工業的快速發展，汽車尾氣的排放、煤的燃燒、涂料、電池和工業“三廢”的排放都是環境中重要的鉛來源[3＼]，盡管目前含鉛汽油、焊料和涂料的使用越來越少，但鉛化合物具有高穩定性，可在環境中滯留很長時間，且不易降解。近年發現，重金屬元素的毒性取決其化學形態[4＼]，通常有機鉛化合物的毒性大于無機鉛化合物[5＼]，研究表明，四乙基鉛和三乙基鉛對人體的毒性最強，其毒性是無機鉛的10～100倍[6＼]。然而，藻類是海洋中的初級生產者，作為自養生物需從環境中吸取足夠的無機鹽，來進行同化作用[7＼]，當藻類從海洋環境中吸收鉛，會在體內積累，不易代謝與降解。海洋中多種魚和貝類以藻類為食，通過食物鏈的逐級濃縮，最終將重金屬鉛傳遞進入人體，對人類健康構成一種潛在的危險。因此，建立一種能夠快速、準確地檢測海藻和其它生物樣品中有機鉛和無機鉛的方法尤為必要。 
　　目前，根據形態分析的特點及試樣的復雜性，許多研究者已嘗試將離子色譜（IC）、高效液相色譜（HPLC）等現代分離技術，與電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）或原子熒光光譜（AFS）[8～12＼]等元素選擇性檢測儀器結合來測定金屬元素化合物的不同形態[13～16＼]，但大部分聯用技術都存在分析時間長、操作復雜、靈敏度或準確性低等問題[17＼]。與之相比，毛細管電泳（CE）則具有消耗樣品少、分析速度快、高分離效率等優點[18＼]，而ICP-MS在元素檢測方面具有靈敏度高、元素選擇性高、干擾小等優點，兩者聯用可成為一種強有力的元素形態分析工具[19～21＼]，自1995年Olesik等[22＼]首次發表了CE-ICP-MS聯用技術的報道以來，此聯用技術逐漸得到廣泛關注及應用[19，23＼]。 
　　本研究通過優化流動相、分離電壓及樣品處理等條件，建立了CE-ICP-MS聯用技術測定海藻中重金屬鉛不同形態分析方法，此方法準確、可靠，不同鉛形態化合物能有效分離，可為海產品安全評價和質量控制提供技術支撐。 
　　2實驗部分 
　　2.1儀器與試劑 
　　CEiSP20毛細管電泳儀（中國Reeko公司）；Agilent7500a電感耦合等離子體質譜（ICP-MS，美國Agilent公司）；未涂層熔融石英毛細管（85cm，內徑75μm，外徑365μm，永年縣銳灃色譜器件有限公司）；MARS密閉微波消解儀（美國CEM公司）；TTLDC氮吹儀（北京同泰聯科技發展有限公司）；FE20實驗室pH計（梅特勒托利多儀器有限公司，上海）；MilliQ超純水處理系統（美國Milipore公司）；真空冷凍干燥機（美國Labconco公司）；AL104型電子天平（瑞士MettlerToledo公司）。 
　　PbCl2（美國StremChemicials公司）；氯化三甲基鉛（TML）和氯化三乙基鉛（TEL）（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；硼砂（分析純，天津市天河化學試劑廠）；硼酸（分析純，上海亨達精細化工有限公司）；NaOH（分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司）；CTAB（美國Sigma公司）；EDTA（華盛化工試劑公司）；甲醇（色譜純，上海化學試劑有限公司）；濃HNO3、H2O2（優級純，德國Merck公司）；液氬（純度99.999%）；10mg/LLi，Co，Y，Tl和Ce的調諧溶液（美國Agilent公司）；實驗用水均為MIlliQ超純水（18.2MΩ/、cm）等。 
　　2.2實驗方法 
　　2.2.1樣品前處理采集新鮮海藻樣品（如紫菜和海帶等），洗凈泥沙，取其可食部分作為樣品， 20℃冷凍過夜后，冷凍干燥，再用粉碎機粉碎并過80目篩，密封保存備用。（1）HTK微波消解預處理準確稱取約02000g干燥樣品于100mL消解罐中，依次加入6mLHNO3和2mLH2O2，密封，常溫下預消解約30min，放氣，然后按表1消解程序進行微波消解，消解完全冷卻后，用超純水定重至25.0g，利用ICPMS測定樣品中重金屬鉛的含量。（2）HTK不同鉛形態提取有機鉛：首先準確稱量05000g樣品于100mL圓底燒瓶中，加入10mL50%甲醇溶液，插上球形冷凝管，接上冷凝水管，進行微波輔助萃取，在攪拌轉速為300r/min、溫度為70～80℃、功率為400W下，每次加熱5min，加熱3次，每次間隔2min，冷卻至室溫，收集提取液，然后用022μm聚丙烯微孔濾膜過濾分離，重復上述提取步驟一次，收集兩次過濾液得到有機鉛提取液。無機鉛：將以上剩余的殘留物用10mL05mol/mL乙酸微波輔助萃取，攪拌轉速為300r/min、溫度為70～80℃、功率為400W下，每次加熱5min，加熱3次，每次間隔2min；冷卻室溫，提取液用022μm聚丙烯微孔濾膜過濾，重復上述提取步驟一次，收集兩次過濾液得到無機鉛提取液。將兩種萃取液混合到一起，氮吹至近干，用少量運行緩沖稀釋，待測，取20μL樣品，加入適量EDTA螯合10min，最后稀釋至400μL，進行CEICPMS檢測。 　　2.2.2測定條件HTK（1）ICPMS條件射頻功率ZH（1350W；采樣錐為鉑錐；采樣深度6.5mm；等離子體氣流速15.0L/min；載氣流速1.2L/min；輔助氣流速1.0L/min；霧化室溫度2.0℃；JP積分時間1.0s。（2）HTKCE條件分離電壓 13kV；毛細管柱（未涂層熔融石英毛細管）85cm×75μmi.d.；緩沖溶液70mmol/LH3BO317.5mmol/LNa2B4O7（pH8.90）；電動ZH）進樣時間為12s；泵速100μL/min；分離時間20min。每次測試前，分別用超純水、1mol/LNaOH、0.1mol/LNaOH、運行緩沖溶液沖洗毛細管15min，每兩次進樣之間，分別用超純水與運行緩沖溶液沖洗毛細管2min。所有溶液進樣之前，均需用045μm濾膜過濾。 
　　2.2.3標準溶液配置分別用超純水將3種鉛的標準貯備溶液逐級稀釋，分別配制成濃度為10，20，50，100和200μg/L的混合標準溶液系列，超純水作為標準空白。采用等離子體色譜軟件計算各色譜峰的積分面積并繪制校準曲線。 
　　3結果與討論 
　　3.1CE條件的優化 
　　3.1.1分離電壓與泵速的優化考察了分離電壓（ 10～ 15kV）對3種形態鉛化合物的分離效果，實驗結果表明，負電壓較高有利于提高霧化效率、縮短遷移時間，但負電壓過高會增加毛細管的電場強度，產生大量的焦耳熱，使分離峰逐漸變寬。綜合考慮重現性、分離度和峰型，選擇 
　　13kV作為分離電壓。同時，考察了CE泵速對分離效果的影響，結果表明，適當增大泵速有利于縮短遷移時間，提高靈敏度，但泵速增大到一定程度后，各種鉛化合物會出現拖尾，重現性變差。最終選擇泵速為40μL/min，Pb、TML和TEL的分離效果較好。另外，此泵速下通過三通接口實現了CEJP與ICPMS的高效連接（圖1），通過負極支管泵入5%甲醇溶液，大大提高ICPMS的進樣量和霧化效率，克服了CE進樣量低的缺陷。 
　　3.1.2緩沖液pH值的優化實驗考察了H3BO3Na2B4O7緩沖溶液pH值在8.60～9.10范圍內對3種形態鉛化合物分離效果的影響，隨著緩沖溶液pH值的改變，各峰的分離度、遷移時間、峰形、靈敏度均會發生變化（圖2）。當pH=9.10時，Pb、TML與TEL雖能分離，但TML與TEL的分離效果較差； 
　　當pH<9.00時，Pb、TML與TEL可以實現基線分離；當pH=8.90時，Pb、TML與TEL的分離效果、遷移時間、靈敏度均較理想；當pH<8.90時，Pb、TML與TEL均能完全分離，但各峰遷移時間延長，隨pH值減小，TML與TEL遷移時間顯著延長，綜合考慮分離度和遷移時間，選擇最佳pH=8.90。 
　　3.2方法學考察 
　　3.2.1穩定性分析在最佳CEICPMS條件下，考察了方法的重現性，重復測定3次100μg/L鉛形態化合物標準溶液。3種形態鉛化合物遷移時間的RSD<4%，峰面積的RSD<5%（圖3），表明方法的穩定性和重現性較好。 
　　3.2.2鉛形態標準曲線及檢出限最佳CEICPMS條件下，測定（10，20，50，100和200μg/L）的鉛混合標準溶液（表2和圖4），在10～200μg/L的濃度范圍內，3種形態鉛化合物的信號強度（峰面積）與濃度之間的線性相關系數均大于090；在連續進樣模式下，Pb、TML和TEL的CEICPMS儀器檢出限（3S/N）以鉛計分別為0091，0023和0030μg/L。 
　　3.2.3海藻中鉛提取率為了考察提取方法的可靠性，研究中選取海帶、海苔和紫菜樣品（干樣），采用微波消解和分步提取（合并提取液）法處理樣品，利用ICPMS測定樣品中分步提取鉛化合物含量和微波消解后鉛含量，結果表明，使用分步提取法提取鉛化合物，提取率較高（表3）。 
　　同時利用海帶樣品為基底，分別加入4μg/L3種鉛形態化合物，提取后測定鉛形態化合物，結果表CM（44明（表4）：在海帶藻類基質環境下鉛形態化合物提取率較高，Pb，TML和TEL回收率分別為103.6%，CM）JP 
　　3.3海藻中鉛化合物測定 
　　分別選擇紫菜和海帶2種海藻，利用加標回ZH（收方法，定性定量分析了海藻中鉛形態化合物的存在形式和含量，將所得的鉛化合物積分計算。 
　　從圖5和圖6可見，紫菜和海帶樣品中鉛化合物主要以Pb形態存在，濃度分別約為3.0μg/g（以Pb計，紫菜干重）和2.5μg/g（以Pb計，海帶干重），基本不含有機鉛形態TML和TEL，進一步證明了藻類細胞壁上含有大量與無ZH）機鉛Pb結合的官能團，可與無機鉛Pb充分接觸，造成Pb2+絡合吸收[24＼]；而有機鉛大部分來源于環境中的尾氣的排放和一些有機鉛的脫烷基作用，然而海藻對其富集和機體內Pb轉化甚少，實驗說明藻類更容易積累無機鉛化合物，可利用大型海藻進行海洋環境中Pb污染的凈化修復。 
　　4結論 
　　建立了CE-ICP-MS聯用技術同時測定3種形態鉛化合物Pb，TML和TEL的方法，樣品消耗量少，3種形態的鉛化合物能夠較好分離，重現性較好，且靈敏度高，采用ICP-MS檢測器實現了較少進樣量中Pb的測定；采用分步法提取海藻中鉛形態化合物，方法簡單、高效，回收率較好。在紫菜和海帶樣品中均只檢測到無機鉛Pb，未檢測到TML和TEL。本方法通過優化分步提取前處理方法，采用CE-ICP-MS聯用技術，實現了海藻中鉛形態的定性與定量分析，為海產品安全評價和質量控制提供了一種實用方法。