MALDITOFMS結合短期培養法快速檢測中段尿樣本中的病原菌

細菌性尿路感染是臨床最常見的泌尿系統感染之一, 中段尿培養是診斷尿路感染的金標準, 但傳統的培養鑒定方法需要2~3 d才能得出細菌鑒定及藥物敏感性結果, 影響了臨床的及時診療。近年來, 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）以敏感、快速、高效的優點而被廣泛應用于臨床微生物的鑒定, 顯著降低了樣本檢測的周轉時間和成本, 但MALDI-TOF MS通常需要培養出單一菌落才能進行鑒定。如何從臨床樣本中直接檢測出病原菌是近年來國內外研究的熱點問題, 但從中段尿樣本中直接檢測病原菌的結果并不理想。本研究采用離心方法富集細菌, 再進行短期培養, 采集菌膜后用MALDI-TOF MS直接檢測, 旨在縮短常規培養時間的同時保證細菌的高檢出率和細菌鑒定的正確性。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2016年4— 7月復旦大學附屬華東醫院門診及住院的1 873例疑似尿路感染患者的中段尿樣本。

1.2 儀器與試劑

Vitek MS微生物鑒定儀及配套試劑、Vitek 2 Compact微生物鑒定儀及配套鑒定卡購自法國生物梅里埃公司, 哥倫比亞血瓊脂平板、中國藍平板購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司。質控菌株包括嗜麥芽窄食單胞菌（ATCC 17666）、產酸克雷伯菌（ATCC 700324）、鉛黃腸球菌（ATCC 700327）、產單李斯特菌（ATCC BAA751）、白念珠菌（ATCC 14053）、產氣腸桿菌（ATCC 13048）和光滑念珠菌（ATCC MYA-2950）, 均由上海市臨床檢驗中心提供; MS校準菌株為大腸埃希菌（ATCC 8739）, 由法國生物梅里埃公司提供。

1.3 方法

每份臨床樣本分為2份, 一份進行中段尿常規定量培養及鑒定, 另一份進行中段尿樣本離心富集、短期培養及MALDI-TOF MS直接鑒定。以中段尿定量培養結合Vitek2 Compact微生物鑒定儀檢測結果為金標準, 評估MALDI-TOF MS結合短期培養法對尿路感染病原菌鑒定的敏感性及特異性。

1.3.1 中段尿常規定量培養及鑒定 按照《全國臨床檢驗操作規程》（第4版）^[13]操作。采用定量加樣槍取中段尿樣本10 μ L, 接種于哥倫比亞血瓊脂平板和中國藍平板上, 5%CO₂、35 ℃孵育18~24 h, 觀察有無菌落生長, 并進行菌落計數。平板生長菌落數× 100即每毫升尿液的菌落數。根據菌落特點、染色和鏡下形態, 并采用Vitek 2 Compact微生物鑒定儀及配套的鑒定卡進行菌種鑒定。

1.3.2 中段尿樣本MALDI-TOF MS結合短期培養法檢測 將樣本混勻后, 取10 μ L滴到玻片上, 自然干燥后, 固定染色。油鏡下觀察細菌數量并進行菌落計數, 在油鏡視野中見到1個細菌相當于尿液中細菌數為≥ 10⁵ cfu/mL^[13]。尿路感染患者尿樣本中的細菌數通常≥ 10⁵ cfu/mL^[13], 所以本研究挑選出菌落計數≥ 10⁵ cfu/mL的尿樣本, 用定量加樣槍取樣本10 mL置無菌離心管中, 以3 000× g離心30 min, 棄上清液9 mL, 剩余1 mL液體及沉淀物震蕩混勻后, 用定量加樣槍取10 μ L接種于哥倫比亞血瓊脂平板上, 5%CO₂、35 ℃孵育, 分別在1、2、4、6和8 h后觀察有無菌膜生長。用 1 μ L定量接種環挑取菌膜點靶, 加入1 μ L基質（α -氰基-4-羥基肉桂酸）, 干燥后放入Vitek MS微生物鑒定儀中進行細菌鑒定, 嚴格按照Vitek MS微生物鑒定儀操作指南操作。

2 結果

2.1 中段尿樣本常規定量培養及鑒定

1 873例中段尿樣本常規培養結果顯示, 菌落計數≥ 10⁵ cfu/mL的樣本381例（陽性檢出率為20.3%）, 其中單一細菌感染的樣本346例（90.8%）, 2種細菌感染的樣本27例（7.1%）, 3種及3種以上細菌感染的樣本8例（2.1%）（考慮為糞便污染可能）; 菌落計數< 10⁵ cfu/mL的樣本595例（31.8%）; 無細菌感染的樣本共897例（47.9%）。

2.2 中段尿樣本短期培養時間與菌膜形成情況

中段尿樣本離心后培養1、2、4、6和8 h, 菌膜生長（指可以采集到足夠的菌量用于直接進行MALDI-TOF MS菌種鑒定）例數分別為0、0、312、371和381例; 其中2種細菌混合生長27例, 3種及3種以上細菌混合生長8例, 革蘭陽性球菌均需要孵育6 h才能培養出足夠菌量的菌膜進行MALDI-TOF MS檢測, 見表1。短期培養1或2 h, 細菌尚未完全生長, 無法進行MALDI-TOF MS檢測, 而8 h與6 h無差異, 但8 h超過了當日報告的時間, 故選擇4 和6 h進行進一步研究。

表1 中段尿樣本不同培養時間菌膜形成情況 （株）

2.3 2種檢測方法對單一細菌生長樣本的檢測

與中段尿樣本常規培養法相比, 單一細菌生長的樣本4 h短期培養后MALDI-TOF MS檢測的檢出率為80.1%（277/346）, 其中腸桿菌科細菌生長較快, 檢出率高（100.0%）, 而生長較慢的非發酵菌檢出率相對較低, 2株嗜麥芽窄食單胞菌未檢出, 鮑曼不動桿菌檢出率為93.0%, 革蘭陽性球菌無明顯的菌膜形成, 均未檢出。6 h短期培養后MALDI-TOF MS檢測的檢出率為97.1%（336/346）, 明顯高于4 h短期培養后MALDI-TOF MS檢測的檢出率, 除了屎腸球菌和糞腸球菌的檢出率分別為76.9%和86.7%外, 其他細菌的檢出率均達100.0%。中段尿樣本短期培養后MALDI-TOF MS的檢測結果與常規培養法結果相比, 除鮑曼不動桿菌（其中有8株只能鑒定到不動桿菌屬）以及糞腸球菌、屎腸球菌（分別有6株和4株未形成菌膜）檢出率偏低外, 其他病原菌的檢出率均為100.0%。見表2。

表2 單一細菌生長樣本常規培養與不同短期培養時間MALDI-TOF MS檢測結果的比較

2.4 2種細菌混合生長的中段尿樣本2種檢測方法檢測結果的比較

常規培養法檢測出27例2種細菌混合生長的樣本, MALDI-TOF MS可以鑒定出其中的優勢菌（菌量較多）, 與常規培養法的檢測結果完全符合。2種細菌混合生長的優勢菌檢測結果見表3。

表3 常規培養法和MALDI-TOF MS結合短期培養法對2種細菌混合生長樣本中優勢菌的檢測結果比較

3 討論

細菌傳統的生化鑒定方法（包括血清學分型）準確、可靠, 但步驟繁瑣, 檢測周期較長。MALDI-TOF MS是近10年發展起來的新的微生物鑒定和分型技術, 具有樣本用量少和檢測快速快、穩定、重復性好的特點。目前, 國內外學者已開展了采用MALDI-TOF MS直接檢測血液或其他無菌體液中病原微生物的研究。之前, 有關采用尿液MALDI-TOF MS直接檢測尿樣本中細菌的研究使用的是離心或洗滌富集細菌的方法, 檢出率為75%~90%, 準確率為70%~91%, 檢測效果不理想。

本研究改進了MALDI-TOF MS檢測前的細菌富集方法。第1步, 離心, 富集細菌; 第2步, 進行短期培養, 提高細菌富集的效率。離心后取富含細菌的沉淀物接種平板, 培養1、2、4、6和8 h, 分別挑取菌膜進行MALDI-TOF MS檢測。結果顯示, 培養1和2 h, 尚未形成菌膜, 細菌生長的量不足以用于MALDI-TOF MS直接檢測。培養4 h, 生長速度較快的腸桿菌科細菌（也是尿路感染最常見的病原菌）形成了肉眼可見的菌膜, 可挑取菌膜直接進行MALDI-TOF MS檢測, 與常規培養法比較, 檢出率可達到100.0%; 而非發酵菌生長速度較慢, 鮑曼不動桿菌短期培養后MALDI-TOF MS的檢出率僅為93.0%, 其中8株鮑曼不動桿菌只能鑒定到不動桿菌屬, 未鑒定到種; 革蘭陽性球菌生長速度慢, 培養4 h尚未形成肉眼可見的菌膜, MALDI-TOF MS無法檢測。培養6 h, 絕大多數革蘭陰性桿菌和革蘭陽性球菌均可以被檢出, 其余3株4 h不生長的鮑曼不動桿菌也形成菌膜并被鑒定, 但8株僅鑒定到屬的鮑曼不動桿菌仍無法鑒定到種（而過夜培養后, 8株鮑曼不動桿菌均可鑒定到種）。除了屎腸球菌和糞腸球菌的檢出率分別為76.9%和86.7%以外, 其他細菌的檢出率均達100.0%。

排除部分糞便污染的臨床樣本, 尿路感染仍以單一細菌感染多見。本研究中單一細菌生長的樣本占90.8%, 2種細菌生長的樣本僅占7.1%。在單一細菌生長的中段尿樣本中, 4 h短期培養后MALDI-TOF MS檢測的檢出率為80.1%（277/346）, 而6 h短期培養后MALDI-TOF MS檢測的檢出率為97.1%（336/346）, 明顯高于4 h短期培養后MALDI-TOF MS檢測的檢出率, 尤其是革蘭陽性球菌可以被充分檢測。上午臨床送檢的中段尿樣本, 經過6 h短期培養, 直接采集菌膜進行MALDI-TOF MS檢測, 可以在當天下班前向臨床發送細菌檢測報告, 臨床醫師可以根據細菌種類的檢測報告及時調整用藥, 得以更加有效地控制尿路感染。雖然8 h培養細菌生長情況更佳（與6 h相比無差異）, 但下班前無法完成檢測, 無法在當天出具檢測報告（臨床醫師下班）, 不能滿足臨床及時更改診斷和對癥治療的需求。而對于部分生長迅速的腸桿菌科細菌, 若臨床有需求, 也可在培養4 h左右、產生肉眼可見的菌膜時, 直接進行MALDI-TOF MS檢測。

部分2種或多種細菌混合生長的中段尿樣本, MALDI-TOF MS可以對其優勢病原菌進行快速檢測, 其鑒定結果與常規培養法結果符合達100.0%。而這些優勢菌往往是尿路感染的病原菌。快速檢測出混合感染中的優勢菌, 對于明確診斷、指導用藥和及時控制感染有著重要的臨床意義。

本研究結果表明, 經過離心集菌后, 再進行短期培養可有效地富集細菌, 直接進行MALDI-TOF MS檢測, 大大縮短了檢測的時間, 同時也保證了細菌的檢出率。同時, 由于分離培養純化了細菌, 彌補了之前國內外報道的采用尿液離心、洗滌集菌后直接進行MALDI-TOF MS檢測所存在的問題, 如尿液中的細菌與有形成分及蛋白混于沉淀中導致質譜信號不好, 尿液未經過培養增菌, 菌量少, 低于MALDI-TOF MS檢出限而導致檢測不出等。本研究采用的離心短期培養后MALDI-TOF MS直接檢測的方法可使細菌檢出率更高, 鑒定結果更加準確。