氣質聯用技術檢測尿琥珀酰丙酮及酪氨酸血癥診斷的應用

發布時間：2018-11-22 21:28 原文鏈接：氣質聯用技術檢測尿琥珀酰丙酮及酪氨酸血癥診斷的應用

氣質聯用技術檢測尿琥珀酰丙酮及其在酪氨酸血癥診斷中的應用

人體所需的酪氨酸由飲食或通過氧化苯丙氨酸獲得, 除供給合成蛋白質之用外, 還是多巴胺、腎上腺素和黑色素等物質的前體。多余的酪氨酸則通過其降解途徑分解為二氧化碳和水。酪氨酸血癥屬于氨基酸代謝紊亂疾病, 是因酪氨酸代謝過程中幾種酶的缺陷所引起的先天性氨基酸代謝異常的疾病, 屬常染色體隱性遺傳。對嬰幼兒和兒童的危害非常大, 絕大多數起病于出生后2~3個月, 大多導致死亡, 少數起病緩慢。異常蓄積的代謝產物主要累積于肝、腎等, 往往導致這些器官發生硬化、衰竭或癌變。酪氨酸血癥根據其代謝途徑中不同酶的缺陷可分為Ⅰ 、Ⅱ 和Ⅲ 型。酪氨酸血癥Ⅰ 型又名肝腎型酪氨酸血癥, 于1956年首先報道, 在這3種類型中最常見, 發病率最高。酪氨酸血癥在世界各地發病率不一樣, 一般新生兒出生的篩查率約1/10萬, 加拿大魁北克法裔人群發病率很高, 可達1/2 000。國內質譜技術的臨床應用起步較晚, 應用不廣泛, 但有報道用串聯質譜技術發現7例患者。酪氨酸血癥Ⅰ 型是由于酪氨酸代謝途徑中延胡索酰乙酰乙酸水解酶活性下降或缺失, 導致患者血中酪氨酸濃度異常升高, 和Ⅱ 、Ⅲ 型一樣。但琥珀酰丙酮(succinylacetone, SA)只存在Ⅰ 型患者體液中, 只有檢測患者體液中具有一定量的SA, 才可診斷為酪氨酸血癥Ⅰ 型。否則, 需進行酶活性檢測或基因檢測。SA是公認的分析診斷酪氨酸血癥Ⅰ 型的指標, 對鑒別診斷酪氨酸血癥和治療具有重要意義。由于SA常溫下保存不太穩定, 體液中濃度也比較低, 一直比較難以測定。但近年來利用先進的色譜質譜技術如高效液相色譜(HPLC)、氣相串聯質譜(GC-MS/MS)和液相串聯質譜(LC-MS/MS)來測定人體液如尿、血漿以及干血濾紙片和組織培養細胞等。我們嘗試建立采用氣相色譜質譜技術(GC-MS)來測定尿液中SA的濃度。

材料和方法

一、材料

1. 樣本收集有肝腫大、嬰肝或血酪氨酸濃度升高的13例患兒的任意尿樣本5~10 mL, 置無防腐劑、15 mL帶蓋塑料離心管或玻璃管中。樣本采集后立即-20 ℃冰凍保存, 可穩定保存至少5 d。

2. 試劑 12 mol/L HCl, 10%和10 mol/LNaOH, 0.9%NaCl(分析純, 上海凌峰化學試劑公司); 10 mg/mL肌酐(奧地利Fluka公司); 0.1 g/mL苦味酸(分析純, 廣東汕頭西隴化工); 0.5 mg/mL H₂O鹽酸羥胺(香港Fluka公司); 乙酸乙酯(色譜純, 美國Tedia公司), 2 mg/mL甲醇SA標準品(美國Sigma公司) ; 內標為5.25 mg/mL丙二酸(美國Sigma公司); 衍生劑為雙三甲基硅烷(BSTFA):三氟乙酰胺(TMCS)=99:1(美國Supelco公司)。

3.儀器及耗材氣相色譜質譜儀(Aglient GC/MS 6890/5973i, 美國安捷倫公司); 毛細管色譜柱(HP-5MS):柱長 30 m, 直徑250 μ m, 膜厚0.25 μ m(美國安捷倫公司); DB-3D吹氮儀(美國Techne公司); SHIMADZU UV-1601紫外可見分光光度計; 離心機; 微量移液器; 渦輪混合器; 高純氦氣和高純氮氣(99.999%, 上海氯閔氣體有限公司)。

二、方法

1. 尿肌酐(Cr)測定采用苦味酸法測定^[8], 并進行改進。(1)Cr標準曲線配制:0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5 mg/mL Cr標準品, 測定方法同樣本測定, 繪制標準曲線; (2)Cr測定:取20 μ L尿樣于10 mL玻璃離心管中, 加500 μ L 1% 苦味酸溶液, 加50 μ L 10% NaOH , 混勻, 室溫靜置20 min, 加2 mL H₂O, 充分混勻, 分光光度計495 nm處測定。原始數據按標準曲線計算各樣本Cr濃度。

2. SA提取取相當于0.6 mg Cr的尿樣(約0.3~5 mL)置于2根潔凈的15 mL帶蓋玻璃管中(一管為測試管, 另一管為對照管), 不足5 mL用0.9% NaCl補足。2管中均加入75 μ L丙二酸(內標), 對照管中加入25 μ L SA標準品, 充分混勻。加入鹽酸羥基烷胺進行污化反應。加600 μ L 10 mol/L NaOH, 調pH值至12~13。充分混勻靜置1 h。加600 μ L 12 mol/L HCl, 充分混勻。每次加5 mL乙酸乙酯, 萃取2次, 每次充分混勻后4 000 r/min(離心半徑為10 cm)離心8 min吸取上層有機相。高純氮氣吹干, 加入衍生劑75 μ L, 65 ℃衍生化20 min, 上機檢測, 進樣2 μ L。

3. GC-MS 柱溫箱起始溫度70 ℃ 3 min; 以10 ℃/min升溫至180 ℃, 14 min; 然后再以16 ℃/min升溫至270 ℃, 2 min; 進樣口溫度250 ℃; 氦氣總流速69.2 mL/min, 不分流; 離子源溫度280 ℃, 檢測范圍50~550 m/z。質譜檢測采用高分辨率選擇離子監測(selected ion monitoring, SIM)模式, 選擇離子質量數分別為212/182 m/z和233/248 m/z。根據加入的內標含量進行定量分析。

4.精密度、準確性、樣本回收率和殘留分析 5 mL去離子水中分別加入SA(2 mg/mL甲醇)標準品1、2、5、10、20、40、80、120、240和480 μ L進行線性關系測定。取10份正常尿樣測定SA濃度, 測定其正常參考值范圍。同一樣本連續測定7次, 連續7 d測定同一樣本, 分析批內和批間變異系數(CV); 連續5 d處理同一樣本, 分析其樣本前處理批間CV。正常樣本中加入一定量的SA和丙二酸標準品, 分析其回收率; 同時根據加入SA標準品與空白對照進行了殘留分析。

5.質量控制測定Cr時同時測定2個Cr質控樣本, 定期校正Cr標準曲線。測定樣本SA含量的同時, 測定加入一定量的SA標準品作為對照。

6.應用用該方法測定高度懷疑有酪氨酸代謝障礙的13例患兒尿樣本。

結果

一、利用建立的方法檢測到SA出現2個峰, 出峰時間約12.03和12.09 min, 丙二酸(內標)峰出現的時間約為8.68 min, 見圖1。

圖1 SA和丙二酸(內標)標準品GC-MG圖

二、用本方法檢測SA的線性范圍為5~120 mg/mL, 線性方程為Y= 0.087 6X +1.435 8, r²= 0.997, 見圖2。SA最低檢測限為2 mg/mL, 最高檢測限為480 mg/mL。本法批內CV為6.8%; 批間CV 7.8%; 回收率在94.0%~102.0%之間; 樣本前處理CV為12.4%; SA殘留分析< 1%。丙二酸(內標)回收率為95.0%~103.0%。10份正常樣本中均未測到SA色譜峰。

圖2 SA實測濃度與加入濃度之間的線性范圍注:Y = 0.087 6X+1.435 8, r²= 0.997

三、用該方法檢測了13例肝腫大、嬰肝或血酪氨酸濃度升高的患兒, 確診酪氨酸血癥Ⅰ 型患者2例。患兒(1):女, 6歲, 肝脾腫大, 并伴有代謝性酸中毒, 父母為近親結婚, 臨床診斷為佝僂病或糖原累積癥; 患兒(2):男, 3歲, 僅表現為肝脾腫大。2例患兒血酪氨酸均有升高, 分別為836和156 μ mol/L, 篩查尿有機酸, 兩患兒尿樣中均出現大量的4-羥基苯乙酸、4-羥基苯乳酸和4-羥基苯丙酮酸, 見圖3。用本法測到患兒尿液中出現大量的SA, 其濃度為26和54 mmol/mol Cr, 因此診斷為酪氨酸血癥Ⅰ 型。見圖4。

圖3 患兒尿有機酸篩查色譜圖注:內標1為二甲基丙二酸; 內標2為二苯基丁酸

圖4 患者(1)和(2)尿樣本中GC-MS圖注:a為患者(1)尿樣本色譜圖; b為患者(2)尿樣本色譜圖

討論

1966年Tanaka等利用GC-MS診斷首例異戊酸血癥后, 上世紀70年代起GC-MS廣泛應用于遺傳代謝病的篩查與診斷中, 成為目前有機酸代謝紊亂的主要檢測方法。但由于常溫下SA非常不穩定, 在患者中的濃度有時也不很高, 正常人尿液中SA更是非常低, 一般都低于質譜儀的檢測極限。所以一旦尿液中檢測到一定量的SA, 即可診斷為酪氨酸血癥I型。目前廣泛采用的有機酸篩查方法一般很難檢測該化合物。本研究采用GC-MS中敏感性較高的SIM模式, 該模式允許只檢測被選定的SA和丙二酸(內標)分子, 不檢測其他可能提取的有機酸等化合物。所以SIM模式敏感性一般比檢測所有有機酸的篩查模式高2~3個數量級, 一般用來檢測體液中濃度較低的一個或特定的幾個分子, 專門用于分析特定的某種疾病或疾病的鑒別診斷。近些年來國外先后報道了利用色譜質譜分析方法測定SA, 那些方法敏感性也很好, 但對實驗室的條件有一定的要求, 作為醫院的臨床檢測成本相對較高。本研究在以往方法的基礎上, 采用更為簡單節約的樣本前處理方法, 在檢測時對被檢測樣本設立一個對照測試樣本, 同時加入內標, 保證每次分析時的準確性, 降低檢測的假陽性率和假陰性率。

本研究利用本法確診了2例高危的酪氨酸血癥Ⅰ 型患兒。在采用GC-MS篩查尿有機酸時, 盡管2例患兒均查出尿樣本中出現大量的4-羥基苯乙酸、4-羥基苯乳酸和4-羥基苯丙酮酸, 而僅根據此結果是無法區分患兒是酪氨酸血癥Ⅰ 型還是Ⅲ 型。酪氨酸代謝途徑見圖5, 可看出這2種類型均可導致尿樣中這2種異常代謝產物的升高, 而只有酪氨酸血癥Ⅰ 型可導致患兒尿中出現大量的SA。本研究重新收集患者尿液并立即冰凍保存, 用本法成功的測到了2例患兒尿中均出現異常的SA色譜峰, 而尿液中大量的SA是確診酪氨酸血癥Ⅰ 型的標志物。一般情況下, 正常人尿液中SA濃度極低, 一般都低于檢測極限, 文獻報道的參考范圍為0~2.5 mmol/mol Cr。