我國學者揭示CRISPRCas效應復合物原子分辨率電鏡結構

　　細菌和古菌中的CRISPR-Cas系統可以特異性識別并降解外源入侵的基因，目前有的系統已開發為最為前沿的基因編輯工具。根據干擾機制的不同，CRISPR-Cas系統主要被分為六種類型。目前，人們對I、II、V和VI型CRISPR-Cas系統的結構和功能研究的較為詳盡，而對其他類型的結構與功能了解相對較少。

　　III型CRISPR-Cas系統的效應復合物（effector complex）可以分為III-A和III-B兩個亞型，它們的特點是具有Cas10蛋白（III-A中被稱為Csm1，III-B中為Cmr2），Cas10通過和其他多個Csm/Cmr亞基及一條crRNA(CRISPR RNA)組裝成效應復合物。該效應復合物既可以降解RNA也可以降解DNA(ssDNA)。當外源基因入侵宿主后，該復合物通過“掃描”入侵者轉錄的RNA以找到與crRNA的guide區域互補的target RNA并與之結合，進而激活Csm3/Cmr4亞基降解此段RNA；同時，該復合物中Cas10的ssDNase活性也被激活，從而將與轉錄產物相關的ssDNA降解；2017年，該系統的另一種獨特的調節機制被揭示，當target RNA出現時，III-A型CRISPR-Cas效應復合物具有腺苷酸環化酶的功能，環化的腺苷酸（cOAn）作為一種新型的第二信使來激活下游Csm6蛋白的非特異性RNA降解活性。

　　該系統如何通過特異性識別以防止誤傷自身的RNA和DNA是人們關心的一個重要問題。生化研究表明，當target RNA序列與crRNA 5’-handle互補時，Cas10的ssDNase活性會被抑制，從而保護宿主DNA免于被降解；而當來自于外源基因的target RNA無法與crRNA 5’-handle互補配對時，則激活Cas10的ssDNase活性。然而，由于目前III-A型CRISPR-Cas效應復合物僅有幾個低分辨率的電鏡結構（17-30埃），所以對于III-A型CRISPR-Cas系統的若干問題，包括其效應復合物的組裝形式，crRNA 5’-handle非互補target RNA激活Csm1的ssDNA切割活性的結構基礎以及促使腺苷酸環化的結構機制是什么等并不清楚。

　　11月21日，中國科學院生物物理研究所江濤團隊和王祥喜研究員等合作在Cell Research 雜志上發表了題為“Cryo-EM structure of Type III-A CRISPR effector complex”的研究論文。該論文解析了來源于T. onnurineus 的III-A型CRISPR-Cas效應復合物3.35埃的冷凍電鏡結構(圖A-B)。

III-A型CRISPR-Cas效應復合物的結構生物學研究

　　A，T.onnurineus中III-A型CRISPR-Cas效應復合物的冷凍電鏡結構全貌；B，A圖中效應復合物所對應的模式圖；C，ToCsm1和2個ATP分子的晶體結構圖；D，ToCsm1的表面電勢圖及預測的target RNA結合通道，結合通道為圖中虛線所示。

　　該項研究所報道的III-A型CRISPR-Cas效應復合物結構組成為Csm1121324151:crRNA，復合物整體呈“長靴”狀，Csm1位于靴底，Csm1的C端和Csm2各形成一個‘helix bundle’并結合在一起組成靴筒，Csm4、Csm3.1、Csm3.2以及Csm5依次從靴底盤旋而上，和靴筒形成類似于雙螺旋的結構。研究人員構建了一條5’端和Csm4結合，并自Csm4起始，貫穿Csm3.1、Csm3.2以及Csm5的crRNA，其中Csm4、Csm3.1及Csm3.2特定的β-sheet依次使得crRNA的8、14和20位堿基發生了翻轉，表明了其降解位點，并得到了后續的生化實驗驗證。

　　此外，研究人員還解析了ToCsm1和2個ATP分子1.69埃分辨率的晶體結構，揭示了環化酶結合ATP分子的預反應狀態（圖C）。通過和其他相關結構的比較，發現ToCsm1的若干結構域的構象變化在宿主保護自我以及激活ToCsm復合物的ssDNA切割活性方面起重要作用（圖D）。

　　該結構是目前第一個解析的原子分辨率水平的III-A型CRISPR-Cas效應復合物，為人們深入理解其功能提供了詳實的結構基礎。另一方面，過去的研究表明，III-A型CRISPR-Cas系統通過組裝不同數目的Csm3和Csm2，以用于結合不同長度的crRNA。但在該報道的結構中，僅僅含有2個Csm3，和1個Csm2，因此這是目前報道的組成最為簡單的III型CRISPR-Cas效應復合物。由于它的體量較小這一特點，也為將其改造成新的基因編輯工具提供了可能性和便利條件。

　　該項目得到了中國科學院先導項目以及國家自然科學基金的支持。