使用珍貴的臨床樣本從蛋白質水平進行轉化醫學研究

　　 一、前言

　　精準醫學旨在針對每位患者的個體差異來調整疾病的預防和治療方法，實現這一目標需要實現精準診斷作為前提。人體在分子水平（蛋白質，RNA，DNA，代謝中間產物）的變化含有大量潛在的診斷信息和治療靶標，通過組學（比如蛋白組，基因組，代謝組）的方式采集更多的分子證據，可以基于不同分子證據的綜合反映來對疾病進行更加精準的判斷和治療。未來從單一生物標記物過度到多重生物標記物（即分子特征），預期可以顯著提高診斷的準確性；多種靶向藥物的聯合治療也會越來越常見。比如早期診斷，對疾病實現精準的早期診斷將大大的提高疾病的治愈率，提高病人的生活質量，有效降低社會醫療負擔。除了早期診斷，生物標志物還可以為醫生提供更多可操作的信息，比如實現基于Biomarker證據的最佳治療方案選擇（預測性生物標志物）和疾病進展監測的預后判斷（預后生物標志物）。問題是臨床樣本中包含豐富的信息，我們如何發現這些信息并和臨床疾病聯系起來？如何選擇有效的技術手段進行篩選？

　　為了更好的篩選Biomarker和治療靶標，研究開始需要提出定義明確的臨床科學問題，比如區分患病和健康人群，比如更加細致的區分疾病發生發展或治療的某一具體階段。

　　二、研究案例思路分析

　　在臨床問題的解決上，大規模的臨床樣本應用篩選時必經的過程，樣本量通常隨著研究要求的證據充分性的要求而不斷增加。下面我們以國際同行認可的發表在高分學術期刊上的2篇文章來分析如何使用珍貴的臨床樣本從蛋白水平進行研究思路，解析主要包含4個方面：

　　1. 提出的明確科學問題

　　2. 針對科學問題如何選擇樣本

　　3. 采用的技術手段

　　4. 研究結果

　　案例1（心血管病領域），影響因子18分（文獻及圖片來源：Circulation. 2018；137:2741–2756. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.034365）

　　1. 提出明確科學問題

　　在分子水平，動脈粥樣硬化被認為是細胞內外數百種蛋白質綜合作用改變細胞的生物學過程和血管局部環境而形成的病理特征。無法通過早期動脈粥樣硬化的診斷來實施個體化治療嚴重阻礙了冠心病的防治。為了改善早期疾病檢測，在臨床癥狀發生之前延緩或中斷疾病進程，很有必要認識動脈蛋白質網絡的動態變化和特征模式。全面了解動脈蛋白質網絡及其在早期動脈粥樣硬化中的變化，可以篩選到新的生物標志物用于疾病檢測和更優的靶標用于治療。

　　2. 針對科學問題如何選擇樣本

　　死亡24小時內的100對尸檢樣本，腹主動脈（AA）和左前降支（LAD）冠狀動脈各1g組織。由病理學家對10毫米長的遠端腹主動脈（AA）和5毫米長的LAD冠狀動脈內膜表面進行如下動脈粥樣硬化特征分級：（1）脂肪條紋（FS）； （2）纖維斑塊（FPs）； （3）復雜病變； （4）鈣化病變；隨后進行蛋白質組學分析。

　　3. 采用的技術手段

　　Label-free蛋白質組學初步篩選鑒定

　　靈敏度和精度更高的DIA（Data independent acquisition也稱為SWATH）進行定量驗證。分別比較LAD 和 AA的 FP（纖維斑塊）vs NL（正常）樣本蛋白量的變化。樣本數量LAD (FP n=15； NL n=30) 和 AA (FP n=9； NL n=18)

　　4. 研究結果

　　通過血管組織進行蛋白組學篩選后，將有分泌潛能的差異蛋白在血清樣本中進行檢測。比較了45名患有血管造影證實的冠狀動脈粥樣硬化（病例）的女性和41名無冠狀動脈疾病體征相似年齡女性（對照組）的空腹血清蛋白水平，發現15個血清蛋白構成的panel能夠很好的預測早期動脈粥樣硬化，AUC=0.93，CI=95%。