治療性抗體藥物的思考

　　前段時間，有小伙伴在公眾號留言說能不能寫點生物藥的文章，不要老是小分子藥嘛。難道你們團隊里只有化學，沒有生物？我們團隊的生物大咖劉博坐不住了，閃開，我來做個分享，絕對干貨！后面還要加鹵蛋！（不對，是彩蛋！）

　　話不多說，直接開始：

　　1897年Paul Ehrlich 提出的“魔術子彈”( magic bullet) 假說是治療性抗體藥物概念的雛形。從提出這一假說至今，抗體藥物的發展已經歷了100多年（圖1）。

圖1：抗體藥物的百年發展歷程

　　1986年美國FDA批準了第一個抗體藥物Orthoclone OKT3上市，截止目前獲FDA批準上市的治療性單抗新藥多達70多個，幾百種治療用抗體處于臨床研發階段。

　　就目前的統計數據顯示，抗體藥物的成功率高于小分子化學藥物，抗體藥物已在腫瘤、自身免疫性疾病領域獲得了巨大的成功，目前抗體藥物最重要的應用領域為自身免疫性疾病和癌癥，隨著對疾病機制理解和研究的深入，抗體藥物已迅速拓展到眼科、抗感染、心血管等諸多領域。并且其適應癥也越來越廣，囊括了不同種類的癌癥、骨質疏松、多發性硬化癥和哮喘等諸多適應癥。

　　治療性抗體藥物發展空間廣闊，據相關資料預測到2021年全球治療性抗體藥物的市場能達到3200億美元的規模，治療性抗體藥物具有巨大的市場容量和空間，對于創新型抗體研發企業，成功開發抗體藥物是抗體研發企業的重要目標，同時也是抗體研發人員為之努力的方向。

　　那么成功的抗體藥物開發首先應從哪方面考量呢？大家首先可能會想到的是抗體藥物的療效和副作用。

　　作為藥，未滿足的臨床需求同樣是抗體藥物研發企業和人員最初需要考量的一個重要因素，也是治療性抗體藥物研發的始動因素和落腳點，任何創新如果偏離了臨床需要都沒有太大的價值和意義。

　　那么我們如何衡量未滿足的臨床需求？簡而言之可以概括為以下2大方面：

　　（1）針對某種疾病，目前還沒有治療藥物；

　　（2）針對某一疾病的藥物，目前療效還不理想或存在部分患者不可耐受的副作用。

　　當然這兩大方面還可以進一步細化，真正臨床需求的確認是需要經過大量的調查和數據分析得出的。抗體藥物研發企業在某一方面能夠做出真正滿足和解決臨床需求的差異化的產品，就是巨大的創新，在抗體藥物研發和后期的商業化推廣中就更可能獲得成功。

　　大家注意，是否是真正的臨床需求是需要研發企業充分調研不同醫院的一線醫生、病人及考察相關的產品、技術、市場等多個維度得出的綜合判斷。在我們接觸的新藥研發企業中也發現有的企業根本沒有經過上述的訪談、調研和分析，就僅憑個別醫生及資料的調查就認定自己開發的產品能滿足臨床需求解決實際問題，其實這樣做出的結論是很不客觀和真實的，對于這樣的企業我們首先就會打上一個大大的問號。

　　為什么說這一點很重要，因為對于創新藥企包括創新性抗體藥物研發企業來說，這是一個方向性問題，涉及到后續的立項策略和靶標選擇，如果方向錯了就好比我們開車去一個目的地，走錯了方向南轅北轍，無論如何都到不了終點，同樣對于抗體藥物開發來說也很難實現最終的價值，也難以獲得成功。

　　上面分析的以解決未滿足的臨床需求為目標的抗體藥物研發策略屬于戰略層面的問題，那么如何實現這一目標，做出一些差異化的抗體藥物就是戰術層面的問題，分析FDA已經批準上市的70多個治療性抗體藥物以及目前處于臨床后期研發階段的幾百個抗體藥物，我們可以發現這些治療性抗體藥物的研發有兩方面的重要變化：

　　（1）抗體藥物的副作用可控，功能及療效不斷改進提升；

　　（2）單抗藥物作用靶標不斷擴大已拓展到新的疾病治療領域和新的適應癥。

　　治療性抗體藥物研發企業可以圍繞上述兩個方面開發一些能解決和滿足實際臨床需求的差異化產品，這兩方面同樣也是剖析抗體藥物研發企業及相關產品價值的關鍵考量因素。

　　下面我們圍繞這兩方面并結合具體的實例來具體分析。

　　抗體藥物質量控制貫穿于從抗體藥物最初研發到病人使用的全過程，關于抗體全流程的質量控制的文章很多，本文就不再詳細闡述。這里我們主要談談上面提到的抗體藥物研發的兩大方面的變化。

　　我們首先看看第一個方面：影響治療性抗體藥物副作用、功能及療效的主要因素——治療性抗體的免疫原性和效應功能，結合具體的實例分析一下。

　　1、通過削弱抗體藥物的免疫原性以提升抗體藥物的功能及療效降低因免疫原性引起的副作用

　　 我們可以通過四種方式降低抗體的免疫原性，消除人抗鼠（HAMA）反應：

　　（1）抗體人源化和開發人源抗體：可以通過移植鼠抗體的CDR到人抗體的相應部位和正確融合鼠抗體CDR 到人Ig 胚系框架中并建庫用相應抗原篩庫來實現； 截止2018年11月FDA批準的70多個治療性抗體新藥中全人源化單抗或人源化單抗藥物已經成為主流，目前人源單抗的生產技術主要有轉基因小鼠技術、抗體庫技術、人工設計人源化抗體、EB病毒轉化人B細胞、人-人雜交瘤細胞技術等，目前已經上市的全人源抗體中，大部分是通過轉基因小鼠獲得。

　　（2）通過分析設計去除抗體上能被人T 細胞識別的表位實現；

　　（3）通過引入Treg 表位并刺激Treg細胞功能，誘導對異源蛋白的耐受實現；

　　（4）通過糖基化修飾的改造來實現。

　　當然抗體藥物的免疫原性還和其他一些因素有關，比如說給藥途徑，給藥的頻率，用藥時間的長短以及病人自身免疫系統的狀態，抗體藥物生產過程中的問題，比如說雜質、聚體或其它污染物等。

　　因此抗體藥物不光是在研發階段，在抗體藥物上市以后的使用過程中都需要嚴密的監測。對于抗體人源化的過程中需要我們充分考慮影響抗體穩定性及成藥性的多種因素作出綜合設計分析，從全局進行把控。在抗體藥物研發進程中盡可能早的發現和去除影響抗體藥物ADA的因素，尤其是抗體序列和結構上可能影響抗體藥物ADA的因素，盡可能避免到抗體藥物研發的較后期發現ADA而造成重大的損失

　　2、通過增強抗體的穩定性及效應功能以提升抗體藥物的功能和療效

　　目前FDA批準的抗體藥物大都以IgG抗體為主，本節我們以傳統的IgG抗體結構以及具體抗體藥物的例子來分析增強抗體效應功能的策略。目前上市的以傳統IgG結構為基礎的治療性抗體可以通過優化和改造Fab及Fc片段來增強抗體藥物的穩定性及效應功能（圖2）。

圖2增強抗體藥物效應的方法

　　2.1抗體Fab片段的優化

　　抗體Fab片段的CDR區參與了抗體與抗原的結合，通過與抗原結合發揮抗體的效應功能，抗體結合抗原以后可以阻斷或中和靶分子的生物學功能，或與細胞膜表面分子結合引起細胞內信號通路的變化誘導細胞凋亡或抑制細胞增殖；通過結合靶標抗原調節人體的自身免疫系統或激活免疫細胞。

　　 對抗體Fab片段CDR區域及框架區的優化可以提高抗體特異性、親和力及結合動力學的特性進而增強抗體的穩定性及效應功能。下邊我們看幾個例子：

　　（1）通過優化奧馬珠單抗（omalizumab）CDR殘基提高抗體親和力以增強體內效力

　　 普特南等人研究了高親和力抗IgE抗體-1（HAE1），該抗體是FDA批準的奧馬珠單抗的高親和力版本。HAE1與奧馬珠單抗IgG1框架相同但CDR序列不同，其中9個CDR殘基的變化使HAE1的koff降低約22倍，并且對IgE的結合親和力提高約23倍。食蟹猴PK / PD研究中，HAE1只需要較低的濃度來抑制游離血清IgG水平，這表明HAE1的較高親和力可能轉化為更高的體內效力。

　　（2）優化帕利珠單抗增加kon來提高親和力可以改善單抗IgG形式的病毒中和作用

　　帕利珠單抗(Palivizumab，商品名Synagis)是靶向呼吸道合胞病毒的人源化單抗，屬于兒科領域的“重磅藥”。帕利珠單抗可通過結合病毒表面上的RSV融合蛋白而阻斷膜融合過程，也可以阻止被RSV感染的細胞間的融合過程，該抗體藥物主要用于預防小兒呼吸道合胞病毒(RSV)感染。Wu等人應用定向進化方法來改善帕利珠單抗與RSV F蛋白的結合率（kon）和解離率（koff），并發現通過增加kon來提高親和力可以改善單抗IgG形式的病毒中和作用，但是在提高抗體親和力的同時需要同時充分考慮抗體的PK特性和組織的生物利用度。

　　那么抗體藥物來說親和力是不是越高越好呢？

　　對于抗體的親和力我們需要辯證地去看，對于作用于不同靶標的抗體我們需要有區別的去分析判斷，對于抗體藥物來說其親和力并不是越高越好，親和力提高有可能提高抗體的療效但同時也面臨導致副作用增大的風險，當然抗體的親和力降低，副作用可能會降低，但藥效可能下降。

　　因此我們優化抗體親和力的時候，需要兼顧到副作用和療效，根據不同的作用靶點以及靶點在不同組織器官的表達情況確定抗體藥物適合的親和力，找到副作用及療效的平衡點。

　　例如靶向EGFR 家族的抗腫瘤抗體藥物可細分為靶向表皮生長因子受體EGFR的抗腫瘤抗體藥物，靶向HER-2 的抗腫瘤抗體藥物，靶向血管內皮生長因子VEGF／VEGFR 的抗腫瘤抗體藥物。

　　其中以表皮生長因子受體EGFR為靶點的單抗藥物已上市的有Cetuximab（西妥昔單抗）、panitumumab（帕尼單抗）和尼妥珠單抗（泰欣生，Nimotuzumab），它們用于治療轉移性結腸癌和頭頸部腫瘤，通過阻斷EGFR 信號通路發揮作用。

　　在Cetuximab（西妥昔單抗） 和panitumumab（帕尼單抗）治療中，最常見的不良反應是皮膚反應（如過性痤瘡樣皮疹）和低鎂血癥（EGFR在腎髓袢中高表達），帕尼單抗的Kd為5×10-11（M）,因此皮膚副作用相對較大，尼妥珠單抗（泰欣生，Nimotuzumab）的Kd約為2×10-8，皮膚的副作用較低。

　　靶向HER-2 的主要抗體藥物為trastuzumab（曲妥珠單抗），通過阻斷HER2 相關信號通路起作用，主要用于治療乳腺癌和胃食道癌。此類藥物常見副反應有心臟毒性、心力衰竭，有時有嚴重過敏反應，輸液反應和肺中毒等，對于此類靶點的抗體親和力同樣不能太高，因此抗體親和力的優化是需要我們在充分考慮成藥性的前提下進行的。

　　抗體Fc區域的糖基化改造

　　單抗Asn297處的糖基化模式調節了抗體Fc結構域與Fc受體結合的構象狀態。 這些N-聚糖對FcγR結合位點的結構完整性至關重要，已經證明糖基化的去除消除了FcγR親和力和補體結合/效應功能。目前已經證實減少巖藻糖和唾液酸基團并增加二等分N-乙酰葡糖胺，半乳糖和甘露糖可增強Fc介導的ADCC和CDC效應。

　　下面我們來看幾個臨床上成功的例子。

　　mogamulizumab是一種靶向CC趨化因子受體4型（CCR4）的人源化單克隆抗體，被FDA批準用于復發或難治性CCR4陽性T細胞白血病或淋巴瘤的患者的治療。obinutuzumab（GA101，Gazyva），是一種含有N-乙酰葡糖胺的非巖藻糖基化抗CD20單抗藥物，Obinutuzumab于2013年被批準用于治療先前未治療的慢性淋巴細胞白血病（CLL）患者。

　　與第一代產品利妥昔單抗（美羅華）相比，第二代產品obinutuzumab去除了50%的鹽藻糖修飾并包含二等分N-乙酰葡糖胺，對人FcγRIII的親和力較第一代產品高50倍，其對表達CD20的淋巴瘤細胞系的ADCC效應增加了10-100倍，在臨床上也體現了治療的優越性。

　　目前國內天廣實開發了第3代產品MIL62，MIL62是利妥昔單抗（美羅華）與阿托珠單抗（GA101）的優效產品（me-better）。MIL62是100%巖藻糖敲除的第三代CD20抗體，目前體外藥效學證明有效于進口產品美羅華。

　　第三個例子是benralizumab（Fasenra），該抗體是人源化的非巖藻糖基化的抗IL-5Rα抗體，其介導與表達IL-5Rα的嗜酸性粒細胞的ADCC消耗效應顯著，所述嗜酸性粒細胞涉及哮喘急性發作。Reed等人通過臨床研究發現通過單次靜脈注射benralizumab（MEDI-563）就可以導致輕度哮喘患者嗜酸性粒細胞的強烈消耗，效果可以持續8-12周。

　　 抗體Fc區域的氨基酸突變改造

　　通過于抗體Fc結構域中引入氨基酸的點突變可以增強抗體Fc效應功能。該方法不僅僅限于對FcγRIII的改變，還允許突變Fc結構域中與多個活化FcγR有關的區域。

　　一系列已上市治療性單抗藥物（利妥昔單抗，西妥昔單抗，曲妥珠單抗和阿侖單抗）的Fc區域的突變體顯示出FcγRIIIA親和力的增加及FcγRIIB親和力的降低，這些抗體Fc區域的雙突變體（Ser239Asp / Ile332Glu）和三聯突變體（Ser239Asp / Ile332Glu / Ala330Leu）增強了ADCC活性。 這些突變體在臨床前體外實驗中顯示出2個數量級的體外效應功能增強，能夠作用于表達低水平靶抗原的細胞，并在體內臨床前模型中顯示出細胞毒性效力的增強，當然這些突變體的臨床療效還需要進一步證實。

　　幾項臨床前研究同樣也表明Fc蛋白工程化單克隆抗體對癌癥和病毒的體內活性增強，目前這些單克隆抗體已進入臨床開發階段，例如治療白血病的CD19抗體 Xmab5574（MOR00208），用于治療乳腺癌的HER2抗體margetuximab。

　　此外我們還可以突變抗體Fc片段的Gly236Ala以增強抗體藥物的ADCP活性，其選擇性地增強對FcγRIIA的親和力，通過Gly236Ala突變（巨噬細胞介導的ADCP和NK細胞介導的ADCC）以及Ser239Asp / Ile332Glu雙突變的聯合（ADCC增強）進一步增強抗體的效應功能。

　　此外，位于上鉸鏈區的突變可以增強與C1q的結合以增強抗體的CDC活性。其他位置的點突變，如CH2結構域中的Lys326Trp和Glu333Ala，已被證明可以增強CDC效應。 雙突變體，如Lys326Trp / Glu333Ala，Lys326Ala / Glu333Ala和Lys326Met / Glu333Ser，以及三重突變體，如Ser267Glu / His268Phe / Ser324Thr，與單個突變相比，其抗體的CDC效應進一步增加。

　　設計新功能抗體

　　新功能抗體藥物是當前及未來抗體藥物開發的一個重要方向，通過開發新功能抗體來提高抗體藥物的療效，新功能抗體主要有抗體偶聯藥物（ADC），雙特異性抗體，納米抗體，Fab片段，ScFv結構的抗體，抗體融合蛋白等。這些抗體的特點和優勢大家從很多公開資料中都能了解，這里就不再詳細闡述。簡而言之，開發這些抗體的最終目的還是希望提高抗體藥物的效應功能，使抗體藥物的臨床療效提升或副作用改善從而實現較已有藥物差異化的競爭優勢。

　　為了實現上述目標，我們應從哪些方面去努力呢？總的來看有兩個重要的方面：

　　（1）首先應該進行詳細和充分的文獻、ZL調研，仔細分析研究目標抗體及對應靶標涉及到的全部文獻及ZL材料，例如目前針對這一抗體及作用靶點已經開展了哪些研究，哪些方面是未研究的，為什么沒有相關的研究，在針對該靶點的抗體藥物設計方面哪些是可以近一步改進和提高的，以及這些改進和提高對于提高臨床療效及減少副作用的關系有多大，對于以上方面的理解深度將會影響抗體藥物的后續開發，要出色的完成上述工作對于相關人員的知識儲備和經驗的積累也具有很高的要求；

　　（2）要求抗體藥物研發人員對抗體整體及各部分的結構功能有很深的理解，此外還需要對不同類型的IgG抗體的結構有清晰的認識，清楚的明白關鍵結構域中每一個氨基酸的變化對于抗體結構和功能的影響，并能綜合運用現有的各種方法手段進行分析驗證。在上述基礎上用多種不同的體內外模型對相關設計進行多次重復驗證，此外抗體各部分連接的氨基酸也很重要，連接linker的穩定性，連接序列的剛性及柔性的組合策略，不同氨基酸的搭配組合，充分考慮所用氨基酸的電荷性質等等。做到上述這些方面，往往會使我們設計的抗體在療效上體現出一個意想不到的提升效果。

　　以上我們用較大的篇幅分析了抗體藥物研發的第一方面的重要變化：抗體藥物的副作用及功能和療效的提升方面。

　　下邊我們看看文章開篇提到的第二個方面：單抗藥物作用靶標不斷擴大已拓展到新的疾病治療領域和新的適應癥。

　　抗體藥物的靶標可以分為已經成藥的靶標和未成藥的靶標，對于已經成藥的靶點來說，由于有大量的科學和臨床研究，而且有已經上市的藥物，對于作用于這類靶點的抗體，臨床開發研究的風險較小，我們可以認為靶標的生物學風險基本已經去除，但對于開發針對此類靶點的抗體藥物來說，后期商業化的風險較大。對于抗體研發企業來說能否開發出具有比較優勢的差異化產品至關重要，這個差異化主要體現臨床療效的提升和副作用的降低方面，這也就回到了我們第一部分探討的內容上。

　　對于未成藥的靶標而言還可以細分為兩大類。

　　（1）一類靶標相對比較成熟，目前有大量的基礎及臨床相關的研究，有較多的人類循證醫學的證據，目前已經有該靶點的抗體進入臨床研究，這樣的靶標雖然較有上市藥物的成熟靶點的臨床開發風險大，但是一旦開發成功，應該具有較大的商業價值。

　　（2）另一類靶標就是目前雖然有一些基礎研究，但是臨床和人類循證醫學研究很少，目前也沒有進入臨床階段的抗體，對于這樣的靶標，臨床開發風險極高，對于這樣的靶點很多的時候還是保持一種跟蹤的態度，在概念驗證上作一些初步工作，對相關靶點的研究密切關注，如有重大突破就可以快速跟進。大家可能會問對于抗體藥物的全新靶點（還未報到的靶點）我們是怎么發現的呢，我們可以通過分子流行病學調查，人類遺傳學研究，人類功能基因組學、蛋白組學研究，生物信息學、藥理學、模式動物研究，人類循證醫學研究去發現。

　　總之，抗體藥物的開發必須以臨床需求為核心，解決還未滿足的臨床需求，不斷開發新的靶點和適應癥。對于初創型的抗體藥物研發企業，需要有清晰的自我定位和目標，在抗體作用的靶標上選擇好，可以兼顧不同類型靶點的一個搭配組合，確立好了相關的靶點后就需要在提升抗體藥物功能和療效上下功夫，特別是針對本文分析的抗體藥物免疫源性及抗體藥物副作用及效應功能，通過這些努力以提高抗體藥物的臨床療效，要實現這些還需要抗體研發人員對于抗體藥物的結構和功能的關系有深入的了解，需要抗體研發企業有較深的積累沉淀。

　　為了大家清理理解本文的思路和闡述的邏輯，特配思維導圖一張供大家參考

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