色譜柱填料的種類及選擇（二）

二、怎樣選擇填料粒度

　　目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高;小于3um的填料應用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是僅有的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱數比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而，3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

　　三、如何保證良好的柱性能與柱壽命

　　◆ 認證閱讀色譜柱使用說明書;

　　◆ 使用填充良好的色譜柱;

　　◆ 盡量減少壓力波動，避免機械及熱沖擊;

　　◆ 使用保護柱及在線過濾器;

　　◆ 經常以強溶劑沖洗色譜柱;

　　◆ 充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質微粒與強保留成分;

　　◆ 用穩定的固定相(C18最穩定);

　　◆ 在中等PH值操作(6~8)，用有機緩沖溶液;

　　◆ 色譜柱使用溫度好小于40℃;

　　◆ 硅膠基質的的色譜柱，應保持流動相的PH值范圍在3.0~8.0;

　　◆ 在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉;

　　◆ 流動相中含有緩沖溶液，應注意應95∶5的水及有機溶劑過渡，有機溶劑不能低于5%;

　　◆ 過夜或貯存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機溶劑流動相保存(乙晴好)。

(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。

　　反相色譜填料常是以硅膠為基礎，表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。

　　(2)、聚合物填料

　　聚合物調料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優點是在PH值為1～14均可使用。相對與硅膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性;大孔的聚合物填料對蛋白質等樣品的分離非常有效。現在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。

　　(3)、其他無機填料

　　其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化。由于其特殊的性質，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強，石墨化碳可用于分離某些幾何導構體，又由于HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強，可制成穩定的色譜柱柱床，其優點是可在PH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應用，新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用PH范圍1～14，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優勢尚在進行中。

　　二、怎樣選擇填料粒度

　　目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高;小于3um的填料應用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是僅有的的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱數比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而，3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

　　三、如何保證良好的柱性能與柱壽命

　　◆ 認證閱讀色譜柱使用說明書;

　　◆ 使用填充良好的色譜柱;

　　◆ 盡量減少壓力波動，避免機械及熱沖擊;

　　◆ 使用保護柱及在線過濾器;

　　◆ 經常以強溶劑沖洗色譜柱;

　　◆ 充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質微粒與強保留成分;

　　◆ 用穩定的固定相(C18最穩定);

　　◆ 在中等PH值操作(6~8)，用有機緩沖溶液;

　　◆ 色譜柱使用溫度小于40℃;

　　◆ 硅膠基質的的色譜柱，應保持流動相的PH值范圍在3.0~8.0;

　　◆ 在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉;

　　◆ 流動相中含有緩沖溶液，應注意應95∶5的水及有機溶劑過渡，有機溶劑不能低于5%;

　　◆ 過夜或貯存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機溶劑流動相保存(乙晴)。