高壓液相色譜（HPLC）系統組成(一)

 HPLC系統一般由  輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置 等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等，現代HPLC儀還有微機控制系統，進行自動化儀器控制和數據處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。 
     zui早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫，柱填料從單一品種發展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質結構的質譜檢測器。數據處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是zui簡單的積分儀、計算機、工作站及網絡處理系統。 
一、輸液泵 
1．泵的構造和性能 
    
輸液泵是HPLC系統中zui重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能：①流量穩定，其RSD應＜0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；②流量范圍寬，分析型應在0.1~10 
ml/min范圍內連續可調，制備型應能達到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。 
    
泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應用zui多的是柱塞往復泵。 

    
柱塞往復泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環和梯度洗脫；改變電機轉速能方便地調節流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現多采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式，一般說來并聯泵的流量重現性較好（RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2~0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。 

2.泵的使用和維護注意事項 
    為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩定性，必須按照下列注意事項進行操作： 
    
①防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相zui好在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。 
②流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。 

    ③泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，zui終產生漏液。 
    ④輸液泵的工作壓力決不要超過規定的zui高壓力，否則會使高壓密封環變形，產生漏液。 
    ⑤流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。 
如果輸液泵產生故障，須查明原因，采取相應措施排除故障： 
    
①沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損，需更換。 

    
②壓力和流量不穩。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。 

    ③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。 
3．梯度洗脫 
    
HPLC有等強度（isocratic）和梯度（gradient）洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數目較少，性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現性。 

    梯度洗脫有兩種實現方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內梯度）。 
    兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度zui常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。 
    在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視： 
    
①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。 

    
②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產生氣泡。 

    
③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的zui大壓力。 

    ④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡。

二、進樣器 
    
早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。 

1．隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得zui佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重復性只能達到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制。 

2．停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現"鬼峰"；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。 

3．閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進樣量準確，重復性好（0.5%），操作方便。 

    
六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環體積的50%（zui多75％），并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環體積的5~10倍（zui少3倍），這樣才能完全置換定量環內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。 

    
六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45µm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的zui大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。 

4．自動進樣。用于大量樣品的常規分析。 
三、色譜柱 
    
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。 

    
柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到zui佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使zui好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。 

1．柱的構造 
    色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 
kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm（5~10µm），取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。 

    
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規格也不同：①常規分析柱（常量柱），內徑2~5mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrow 
bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內徑＞5mm；⑤實驗室制備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。 

2．柱的發展方向 
    
因強調分析速度而發展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質譜（MS）聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細管徑柱的優點是：①節省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現LC-MS聯用。 

    
但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。 

3．柱的填充和性能評價 
    
色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度＞20µm時，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。 

    必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在于填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。 
    
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。 

    一份合格的色譜柱 評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。

4．柱的使用和維護注意事項 
    色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。 
    
①　避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。 

    ②　應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。 
    ③　一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。 
    
④　選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。 

    
⑤　避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。 

    
⑥　經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml。 

    
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重復注射100~200µl四氫呋喃數次有助于除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。 

    
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。 

    ⑦　保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。 
    
⑧　色譜柱 使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。 

在后兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。 

    
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。 
    
通常色譜柱 壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質保留于柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。 

    
每次工作完后，zui好用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。