武漢病毒所等篩選得到沙粒病毒入侵抑制劑

　　近日，中國科學院武漢病毒研究所/病毒學國家重點實驗室肖庚富研究組與南開大學藥學院、天津國際生物醫藥聯合研究院共同在Protein & Cell(《蛋白質與細胞》)雜志上發表題為Structure-Activity Relationship Optimization for Lassa Virus Fusion Inhibitors Targeting the Transmembrane Domain of GP2（《靶向拉沙病毒GP2跨膜區融合抑制劑的構效關系優化及其機制研究》）的研究論文。該研究成功篩選得到阻斷四級病原拉沙病毒（Lassa virus， LASV）入侵的抑制劑：化合物21、29、57、72；并對其作用機制進行了詳細闡述。

圖1 四種化合物抗沙粒病毒效果

　　LASV屬沙粒病毒科（Arenaviridae），哺乳類沙粒病毒屬（Mammarenavirus），引發烈性傳染病拉沙熱，被美國疾控中心歸類為A類生物恐怖病原（Category A bioterrorism agent）。LASV的天然宿主是嚙齒類多乳鼠，人主要通過接觸含有病毒的動物排泄物或氣溶膠感染，人與人之間也會發生相互傳播。LASV主要在西非地區流行，每年約30萬-50萬人感染，在住院患者中的致死率最高可達70%，幸存者往往也會伴有耳聾等嚴重后遺癥。在今年年初，尼日利亞爆發了該國史上最嚴重的一次拉沙熱疫情，從1月1日到4月29日，已有420人確認感染拉沙熱，114人死亡。了解LASV的致病機制，發展針對LASV的治療手段非常必要。目前還沒有FDA批準的針對LASV的特效藥物和疫苗，治療手段僅限于在感染早期使用廣譜抗病毒藥物利巴韋林，因此迫切需要研發高效、特異的抗LASV藥物。

　　病毒入侵是病毒生命周期的第一步，是抗病毒藥物設計的重要靶點之一。研究人員構建了以水泡性口炎病毒（VSV）為骨架、囊膜蛋白為LASV囊膜糖蛋白GPC（glycoprotein complex）的假型病毒（LASVpv）和重組病毒（LASVrv），LASVpv和LASVrv由于囊膜蛋白與LASV相同，因此可以在生物安全二級的條件下模擬LASV的入侵過程。由于其攜帶報告基因，可用于高通量篩選實驗。

圖2 LASV-GP2 TM的抑制劑敏感性/耐藥性界面

　　研究人員通過對已報道的由SIGA公司篩選的LASV特異性進入型抑制劑ST-161進行構效關系優化，得到72種衍生物。通過在不同細胞上進行LASVpv和LASVrv抗病毒實驗鑒定出四種SI最優的LASV進入抑制劑：化合物21、29、57、72，其IC50分別為18.92 pM、189 pM、0.2784pM。令人驚喜地發現，化合物57對沙粒病毒科其他四級病原也有顯著的抑制效果，其中對Junín virus (JUNV)、Sabiá virus (SABV)、Chapare virus (CHAPV)的抑制水平達到nM級；對Guanarito virus (GTOV)和Machupo virus (MACV)的抑制水平更是達到pM級，有望成為沙粒病毒的廣譜性抑制劑。

　　為進一步探索四種化合物的作用機制，研究人員通過膜融合實驗，證明四種化合物均能顯著抑制LASV GPC介導的膜融合。且發現化合物57也能顯著抑制JUNV/SABV/CHAPV/GTOV/MACV GPC介導的膜融合，從而抑制病毒的進入。接著通過LASV病毒耐藥株篩選，發現抑制劑21的耐藥點突變是GP2跨膜區（TM）的第428位的亮氨酸（L）突變為絲氨酸（L428S），抑制劑29、57、72的耐藥點突變是GP2 TM的第446位的苯丙氨酸（F）突變為亮氨酸（F446L）。研究發現L428S和F446L及其聯合突變假病毒對四種抑制劑均有顯著的耐藥效果。

　　研究發現耐藥點突變L428S和F446L都是位于GP2 TM α螺旋的同一側，因此，研究人員猜想GP2 TM存在藥物的耐藥性/敏感性界面，接下來他們對GP2 TM進行丙氨酸掃描膜融合實驗并通過化合物29鑒定其敏感性，結果發現GP2 TM α螺旋針對化合物29明顯劃分為耐藥性/敏感性界面（圖2）。

　　實驗證明四種化合物可以顯著抑制LASV的進入，相比于ST-161，顯著提高了抗病毒效果，并具有廣譜抗病毒活性。其作用機制是通過作用于SSP與GP2的相互作用界面，穩定GPC融合前的構象，抑制膜融合而達到抗病毒的效果。以上研究為沙粒病毒的暴發流行提供了藥物儲備，為抗沙粒病毒的藥物研發提供了理論依據與優化策略。

　　南開大學與武漢病毒所聯合培養碩士研究生張光順為論文第一作者，武漢病毒所副研究員王薇為通訊作者。

　　該研究得到國家重點研發計劃(2018YFA0507204)、國家自然科學基金(31670165)、武漢國家生物安全實驗室高端用戶培育項目課題暨中科院高致病性病原生物學與生物安全重點實驗室開放研究基金課題（NBL2017008）、病毒學國家重點實驗室開放課題（2018IOV001）資助。