雙光子熒光顯微鏡的技術特點和使用技巧

　　雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術的一種新技術。

　　雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80 至 100 兆赫。在使用高數值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測效率。為形態學、分子細胞生物學、神經科學、和藥理學等研究領域中重要的研究手段。

　　1.雙光子顯微鏡出現的背景----傳統激光共聚焦顯微鏡的兩大局限:

　　1)一是光毒性現象：因為共聚焦的針孔必須足夠小以獲得高分辨率的圖像，而孔徑小又會擋掉很大部分從樣品發出的熒光，包括從焦平面發出的熒光，相應的，激發光必須足夠強以獲得足夠的信噪比;而高強度的激光會使熒光染料在連續掃描過程中迅速褪色，熒光信號會隨著掃描進程度進行變得越來越弱。

　　2)光毒作用是另外一個問題，在激光照射下，許多熒光染料分子會產生諸如單態氧或自由基等細胞毒素，所以實驗中要限制掃描時間和激發光的光功率密度以保持樣品的活性。在針對活性樣品的研究中，尤其是活性樣品生長、發育過程的各個階段，光漂白和光毒現象使這些研究受到很大的限制。

　　2.為什么說雙光子顯微鏡一般不需要配備紫外激發激光器?

　　雙光子顯微鏡技術是建立在雙光子激發效應的基礎上的一種熒光激發技術：熒光染料分子可以同時吸收低能量的兩個光子而被激發(兩個光子到達熒光分子的時間間隔小于1飛秒)，其激發效果可以等同于吸收一個1/2波長的高能量光子。例如，吸收兩個紅色波長的光子，相當于一個吸收紫外的分子。長波長的光子不易被細胞吸收，因此對活細胞的光毒性減少，也降低了光漂白。這樣即起到紫外激發的功能，又避免了紫外光線對樣品的傷害。

　　3.雙光子顯微鏡的激光器有何特別之處?

　　雙光子吸收幾率依賴于兩個入射光子在空間和時間上的重合程度(兩個光子必須在10-18秒內到達)。雙光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的區域的熒光團才會被激發。因此所用激光器多為鈦寶石激光器，可以達到皮秒或者飛秒級的掃描速度，且具有非常高的峰值功率和較低的平均功率，從而可以減小或者消除光漂白和光毒作用。最主要的是在一個很小的范圍提供非常高密度的光子，可以保證雙光子的同時激發。

　　4.雙光子激發的優點是什么?

　　1)增加了染料的選擇性：共聚焦系統的激光器(Ar, Ar/Kr, HeNe)的激發光范圍在 488nm - 647nm

　　這就意味著想用紫外激發熒光染料的實驗進行，例如使用 DAPI , Hoescht

　　而雙光子的激發波長是單光子的兩倍，所以紫外激發的染料能被近紅外光激發。

　　2)減少光漂白：因為光漂白減少的減少使得用 CFP/YFP 做熒光共振能量轉移( FRET )的實驗的成功率提高。

　　3)無需特殊的物鏡：從硬件的角度出發，用近紅外光的波長激發紫外激發染料不需要特殊的紫外光學組件。

　　4)提高信噪比：激發光波長和發射光波長具有很大的差別，提高了信噪比。

　　5)漂白局限于焦點處：因為熒光激發只發生在物鏡的焦點上，所以就不需要共聚焦針孔了。這樣提高了光的檢測，而且光漂白只發生在焦點上。

　　6)更容易穿透標本：紅外波長的光不易被細胞散射，能穿透更深的標本。

　　5.相對于激光掃描共聚焦顯微鏡，雙光子顯微鏡做的最大改進是什么?

　　1)減少了光漂白。

　　2)減少了光毒性。

　　3)不易散射，更易穿透厚樣品，諸如腦片。