BioTechniques：從外周血中分離cfDNA的高通量方法

　　傳統的ctDNA純化方法首先要通過離心，從全血中分離出血漿，這一步妨礙了自動化的實施。為此，加拿大邁克?史密斯基因組科學中心的研究人員開發出一種方法，能夠高通量地分離ctDNA。

　　在液體活檢中，人們通常需要對游離的循環腫瘤DNA（ctDNA）進行分析。傳統的ctDNA純化方法首先要通過離心，從全血中分離出血漿，這一步妨礙了自動化的實施。為此，加拿大邁克?史密斯基因組科學中心的研究人員開發出一種方法，能夠高通量地分離ctDNA。這項成果發表在《BioTechniques》二月刊上。

　　液體活檢，這種新興技術有望改變癌癥檢測和疾病監控。ctDNA是片段化的DNA，由癌細胞在凋亡或壞死過程中釋放到血漿。通過檢測ctDNA，醫生有望發現癌癥復發或轉移的線索。目前，基于ctDNA的新一代測序檢測已引入科研和臨床實驗室。

　　對于這些檢測而言，第一步當然是純化ctDNA。傳統的方法需要先通過離心從全血中分離出血漿。不過，離心不僅是耗時費力的低通量過程，還容易引起樣品污染和樣品交換。為了突破這些限制，研究人員也在不斷開發純化新方法。

　　在這項研究中，邁克?史密斯基因組科學中心的Pawan K Pandoh及其同事開發出一種基于磁珠的自動化ctDNA分離方法，能夠跳過離心從外周血中直接純化ctDNA。他們將其稱為“blood-direct”cfDNA分離法。

　　研究人員從七名癌癥患者中分別采集了10 ml外周血。對于1-3號患者的樣本，他們以2000 x g離心10分鐘分離血漿，然后分成兩份，以便比較QIAGEN的 QIAamp? Circulating Nucleic Acid kit和Bioo Scientific的NextPrep-Mag cfDNA Isolation Kit。4-7號患者的樣本也同樣分成兩份，以比較NextPrep-Mag cfDNA方法和blood-direct分離方法（實驗策略如下圖）。

（圖片來自原文）

　　blood-direct方法的具體操作如下。在磁珠存在時，在55°C的變性條件下用裂解結合緩沖液和蛋白酶K處理外周血15分鐘。之后將混合物在室溫下孵育1小時，期間每隔10分鐘混合一次。通過磁力架捕獲磁珠，然后加入洗脫緩沖液洗脫cfDNA。之后利用FTA試劑進一步純化cfDNA。隨后，他們開展文庫制備和靶向富集，并在HiSeq 2500儀器上測序。

　　研究人員對四個病例的直接法和血漿法數據進行比較，發現等位基因檢測的結果相當。在19個SNV中，血漿法發現了15個，而直接法發現了16個。并且，兩種方法所得的cfDNA片段大小分布一致。這表明，從血液中直接分離ctDNA可作為一種替代方法，讓整個流程自動化，從而提高實驗通量。

　　研究人員認為，這種blood-direct磁珠方法既適合自動化，又適合低通量的手動處理，比如在沒有實驗室設備的現場護理時。“與Oxford Nanopore等第三代測序技術聯用，cfDNA分析有望帶來快速且經濟的解決方案，不僅可檢測低頻率的突變，還可以檢測甲基化狀態及其他表觀基因組的特征，”他們寫道。