第二期賽默飛世爾科技質譜用戶沙龍活動報道

　　2012年7月27日下午，由賽默飛世爾科技發起，分析測試百科網協辦組織的第二期賽默飛世爾科技質譜用戶沙龍在中科院遺傳發育所成功舉辦。來自賽默飛世爾科技公司、北京出入境檢驗檢疫技術中心、軍事醫學科學院、中科院遺傳發育所的三十多位專家、學者出席了本次沙龍活動。

　　首先，來自賽默飛世爾科技CMD-MS市場經理王勇為博士作了題為《Thermo Scientific at ASMS 2012”（2012 美國質譜年會上賽默飛世爾科技動態）》的精彩報告。

賽默飛世爾科技CMD-MS市場經理 王勇為博士

　　王博士首先為大家簡介了一下ASMS（美國質譜年會），他表示ASMS是一個學術水平很高、規模很大的會議，覆蓋了整個質譜技術及其各個行業的應用，是非常值得參加的一個會議。是質譜界的“世界杯”

　　接下來，王博士介紹了賽默飛世爾科技在ASMS上的新產品和一些動態。王博士表示今年賽默飛世爾的主題是“應用創新”，寓意能夠把產品發揮到最大的水平。在ASMS上，賽默飛世爾主要介紹了新產品在蛋白質組學、藥物研發和食品安全等領域的應用。去年，我們推出了Orbitrap等其它高性能的一些產品；今年我們推出了臺式的高分辨軌道阱、Exactive Plus Orbitrap、TSQ 8000的一臺氣質聯用和TRACE 1300的一臺氣相色譜等新產品。

　　除此以外，還有一臺用于蛋白檢測的納流分析儀——EASY-Spray nano LC。該儀器集成EASY-Spray?柱與EASY-Spray離子源，以及提供極易操作“plug-and-spray”納升級LC-MS系統。不同于其它集成的納升級LC-MS解決方案，它易于使用，高度可靠的EASY-Spray技術使色譜柱耐壓可達1000 bar，用戶可使用到小顆粒(2μm)色譜柱。

Thermo Scientific EASY-Spray納升級LC-MS

　　

EASY-Spray?柱

　　

EASY-Spray離子源

　　王博士說到：“做儀器首先是要提高它的性能，然后是實現高通量，最后是想辦法降低分析成本。這是我們這兩年的目的。我們希望很多的產品能夠實際應用到各個領域中。”

Exactive Plus系統

　　為了使更多的用戶使用我們高端的產品，從產品規劃上，賽默飛世爾有非常前沿的高端儀器，好的常規定量定性的能力，還有高通量的產品。其中高通量質譜中的Orbitrap Elite具有最大化的分辨能力，在m/z為400時高于240,000 FWHM；采用互補的碎裂技術，如碰撞誘導解離（CID）、電子轉移解離（ETD）和 HCD時，該系統還可以獲得更高的蛋白質序列覆蓋率；可應用于自上而下的蛋白質組學的應用。Q Exactive具有140,000 FWHM的高分辨率；高性能的四極母離子選擇；肽與小分子超級的定量能力。Exactive Plus具有140,000 FWHM的超高分辨率；快速掃描速度(頻率)達到12Hz，與UHPLC快速色譜技術聯用時可確保精確質量分析；全面升級的Q Exactive?高性能四極桿 -Orbitrap? LC-MS/MS系統可實現預算和分析上的靈活性；質量范圍擴展至50~6,000 m/z，可分析完整蛋白和單電荷離子。

　　另外，王博士對各種新儀器的應用也做了詳細的講解，結果證明賽默飛世爾的Orbitrap Elite、Q Exactive和Exactive Plus等新產品對食品安全、生物醫藥和環境檢測等領域都有著很好的檢測數據。

　　更多閱讀：

　　賽默飛在ASMS 2012上推出新型Exactive Plus臺式LC-MS系統

　　賽默飛在ASMS 2012上推出新型納升級LC/MS解決方案

　

北京出入境檢驗檢疫技術中心 劉鑫老師

　　來自北京出入境檢驗檢疫技術中心的劉鑫老師帶來的報告題目是《Orbitrap“雙譜庫”技術在食品安全領域的應用》。

　　劉鑫老師來自北京出入境檢驗檢疫技術中心，該中心主要是做食品安全領域的應用課題的一些研究。劉鑫老師這次所講的內容主要有高分辨質譜“雙譜庫”的建設；食品安全檢測應用實例；譜庫的拓展和基于服務器數據庫的檢索三大塊。

　　高分辨質譜“雙譜庫”的建設

　　劉鑫老師首先介紹了“雙譜庫”的概念。“雙譜庫”是“高分辨質譜不對稱雙譜庫技術”的簡稱，從食品安全檢測實際出發提出的創新性技術方法，其包含篩查和確證。篩查即是高分辨質譜全掃描一級譜庫，包括化合物分子結構、中英文名稱、精確分子量參數、毒性信息、安全信息等；確證又是HCD高能裂解二級譜庫。“雙譜庫”的優勢也是非常明顯的，高分辨質譜全掃描一級譜庫既經濟又高效，傳統技術一次篩查數十個化合物，而“雙譜庫”可實現上萬種化合物的篩查；HCD高能裂解二級譜庫具有信息全和可移植性，能夠提供高分辨的多級質譜裂解信息，并確證所用的裂解信息可以在類似儀器上實現共建共享。

　　接下來，劉鑫老師詳細介紹了“雙譜庫”的建設：第一是篩查普庫，目前已建立超過13000種化合物的篩查譜庫，包括食品安全、公共安全領域等，涵蓋農藥、獸藥、食品添加劑、工業染料、有毒物等等，具有信息全、可移植和自動化的特性；第二是確證譜庫,目前已建立的HCD二級譜庫已有106種化合物和848張HCD裂解譜圖，檢驗中心近期又增加了數百個化合物的譜圖（這些仍在整理中），并計劃年底，二級譜庫要達到800種化合物的HCD裂解譜圖，確證普庫具有碎片信息豐富、重現性高和自動化檢索功能的特性。

　　食品安全檢測應用實例

　　報告中，劉鑫老師列舉了“雙譜庫”檢測應用實例：一滴香中塑化劑的研究（有毒物的篩查），檢測出很多增塑劑；蜂蠟中的添加物（人工添加物的檢測）；市售豬肉樣品中抗生素的研究（有目的的篩查與確證）；高分辨質譜對檢測陽性樣品的確證。雙譜庫篩查實驗是由檢驗中心和賽默實驗室合做的。實驗證明檢出率基本都在百分之九十以上。

Orbitrap“雙譜庫”食品安全檢測流程

　　劉鑫老師總結了三重四極桿質譜用于多殘留檢測存在的問題：質譜分辨率不高，對一些分子量接近的化合物無法區分，即假陽性率高；對基質的干擾比較敏感，即樣品前處理方法復雜；目標型檢測模式，即僅目標化合物檢測，不能對非目標化合物進行檢測。而用市售豬肉樣品中抗生素的研究和利用Orbitrap區分三聚氰胺干擾物質等事例進一步說明了“雙譜庫”檢測方法分辨率高的優勢。

　　譜庫的拓展和基于服務器數據庫的檢索

　　最后劉鑫老師又闡述了譜庫的拓展和基于服務器數據庫的檢索(主要是對假陽性的判斷及鑒定)。所采取的措施是，一、整合網絡數據庫，進一步擴大數據庫檢索能力;二、盡可能多的檢出食品中包含的化合物;三、對未知物進行鑒定。劉鑫老師又列舉一些“80萬種化合物譜庫”應用實例，包括1、假陽性干擾物的確證和未知物的結構解析;2、一滴香中未知化合物的解析。

　　劉鑫老師最后說道“我們希望給造假者一種威懾力，告訴他們我們有這樣實力，能夠去檢測”。

,

軍事醫學科學院六所 李敬來老師

　　來自軍事醫學科學院六所的李敬來老師作了題為《苯環壬酯手性對映體體內拆分與立體選擇性動力學研究》的報告，主要從研究背景、研究目的、研究方法上介紹了8021消旋體在比格犬體內測定拆分方法的建立過程。

　　實驗室基本介紹

　　李老師首先為我們介紹了軍事醫學科學院藥物代謝與藥代動力學重點實驗室的基本情況。實驗室組建于六十年代，在“十五”、“十一五”“十二五”期間獲得了國家科技部“863”重點項目基金和重大新藥創制資助，是國內四家全面提升藥物代謝平臺建設之一，在2004年和2006年獲得了北京市科委和國際合作項目的資助，建立了早起藥物代謝性質快速評價的體系;2009年到2010年承擔了117項新藥系統評價的臨床項目，其中包括53項重大新藥創建資助服務的項目。目前實驗室擁有LC-MS10臺、GC-MS2臺、HPLC多臺、專門用于生物技術藥物代謝研究的毛細管電泳儀和定量PCR儀以及配套的放射性同位素實驗室設備。實驗室目前的技術優勢

　　在國內最早開展了生物技術藥物的藥代動力學研究，承擔了國內大部分的生物技術藥物的藥代評價任務。在國內率先采用巨型計算機和VolSurf軟件預測待合成、篩選化合物的細胞膜透性、P-糖蛋白外排及蛋白質結合等體內轉運過程。建立多種體內、體外藥代實驗模型和快速評價技術，配合藥物設計開展化合物成藥性預測。在國內最早利用配套的放射性同位素實驗設備開展研究藥物的組織分布。擁有一個新藥研究多學科合作群體，為藥代動力學研究提供了強有力的技術支持。

　　研究背景

　　苯環壬酯(8021)是研發的創新結構的M受體拮抗劑，消旋體為國家I類新藥被批準上市，主要用于抗暈動藥。大量的實驗研究發現，L-8021在可逆性膽堿酯酶一只雞引發的免逆向轉圈綜合征和貓運動病樣綜合征兩種動物運動病模型上，左旋體比消旋體具有更好的抗暈效果。進一步的藥理學基質研究表明其活性異構體為左旋8021，右旋體無效。開發手性藥物的光學異構體，能夠提高藥效，降低對毒副作用。因此，對手性藥物的單一光學異構體的開發研究已經成為新藥研究的重要內容。

　　研究目的

　　(1)根據SFDA對已上市消旋體開發單一對映體的要求，建立體內手性對映體拆分和定量測定方法，測定優映體轉化為另一對映體的程度是否顯著，研究優映體單獨用藥是否與作為外消旋體組分時的藥代動力學性質一致。

　　(2)比較手性對映體的代謝差異性。

　　(3)為藥效和地理學提供參考依據，逐漸積累手性藥物代謝研究經驗。

　　8021消旋體在比格犬體內測定拆分方法的建立

　　李老師介紹從色譜柱、有機溶劑及比例、緩沖溶液及比例、溫度四個方面摸索了拆分方法的建立過程。

　　手性色譜柱包括有7類：“刷型”手性固定相(CHIRALPAK AD-RH)、手性聚合物固定相(CHIRALPAK AS-RH)、環糊精類固定相(CHIRALCEL OD-RH)、大環抗生素固定相(CHIRALCEL OJ-RH)、蛋白質固定相(ULTRON ES-OVM)、配體交換固定相、冠醚固定相。經過比較最終選擇了蛋白質類的手性柱ULTRON ES-OVM作為固定相。

　　有機溶劑種類對分離度的影響：研究發現將常用的有機溶劑甲醇、乙腈與水混合作為流動相時，均不能獲得良好的效果，而用乙醇、異丙醇時可以得到較好的分離。

　　有機溶劑的比例對分離度的影響：在手性拆分時對有機溶劑的要求比較高，因為比例的變化范圍比較窄，有機相的比例越低在手性柱上的保留時間會越長，研究中發現當乙醇比例在16%時分離效果最好。

　　有機添加劑(緩沖液)種類和比例對分離度的影響：在使用5mM磷酸氫二鈉和5mM乙酸銨作為緩沖液進行分離的時候比較發現，采用5mM的乙酸銨可以達到較好的效果。

　　溫度對分離度的影響：升高色譜柱溫度會使峰形變得鋒利，縮短分析時間，但是會降低分離度，因此需要稍稍降低色譜柱的溫度。

　　研究結果

　　考察了手性固定相、有機溶劑種類和比例、緩沖溶液種類和濃度對對映體拆分的影響，建立了生物樣品中8021手性異構體分離定量方法，為手性藥物立體選擇性動力學研究提供了方法學基礎。

　　實驗結果證明8021優映體在動物體內均不發生構型轉化，闡明了藥效作用手性物質基礎就是優映體本身。

　　8021以外消旋體形式用藥時，右旋體的吸收程度明顯高于左旋體，并抑制左旋體的吸收，左旋體單獨用藥時吸收程度明顯高于消旋體給藥，開發左旋體能增加藥效并且降低副作用。

　　采用LC/MS/MS和GC/MS分析鑒定手段，結合穩定性同位素摻入技術，8021左旋體和消旋體在大鼠體內均發現11個代謝產物，其中4個結構與以往相同，7個為新發現產物。大鼠灌胃給藥8021左旋體和消旋體后，代謝產物基本一致，但代謝產物量上有明顯差異。

中科院遺傳發育所 劉科輝 老師

　　來自中國科學院遺傳與發育生物學研究所的劉科輝老師作了《Orbitrap Elite在翻譯后修飾蛋白質組研究中的初步應用》的精彩報告。

　　中科院遺傳與發育所概況

　　2001-2003年經由原中國科學院遺傳研究多、發育生物學研究所及石家莊農業現代化研究所整合而組成，構建有植物基因組學國家重點實驗室、植物細胞與染色體工程國家重點實驗室、分子發育生物學國家重點實驗室和河北省節水農業重點實驗室。遺傳發育所瞄準農業可持續發展和人口健康的歸家重大戰略需求，針對重要農藝性狀分子機理、細胞分化與器官發育、生物分子網絡、動植物品種設計以及農業資源高效利用等領域的關鍵科學問題，開展原始創新和繼集成創新研究，提出和發展具有重大影響的科學理論和概念;建立和完善動植物品種分子設計和培育的方法，重要遺傳疾病研發以及農業資源高效利用的技術體系。

　　目前實驗室配備的研究蛋白質的儀器設備包括LTQ-Orbitrap-Elite、TripleTOF 5600、Autoflex MALDI-TOF等。

　　蛋白質組學的介紹

　　蛋白質組的研究與其他的小分子的研究有點區別，后者主要是發現和研究大自然中已經存在的對象，前十年的研究中蛋白質組學致力于由蛋白質根據中心法則尋找對應基因的庫的建立，目前的重點在于研究在有基因轉錄翻譯成蛋白質的過程中會發生很多的修飾，而這些修飾才是執行生物功能的關鍵，研究這些修飾是對蛋白質組學研究的一項挑戰。

　　翻譯后修飾的認識

　　翻譯后修飾是翻譯后的化學性修飾，在功能性蛋白質的合成中發揮著重要作用，通常是來調節細胞活動的，能夠發生在蛋白質生命周期的任何一步，蛋白質的翻譯后修飾在蛋白質性質的修飾上是可逆的，存在有200多種翻譯修飾的酶，包括激酶、磷酸酶、轉錄酶和連接酶等。

　　翻譯后修飾包括磷酸化、泛素化、甲基化、糖基化、類泛素化、硝基化、乙酰化、酯化等修飾。

　　Orbitrap Elite組合式質譜儀

Thermo Scientific Orbitrap Elite組合式質譜儀結構

　　劉老師所在課題組利用Orbitrap Elite組合式質譜儀的特點，針對著以上翻譯后的修飾進行了許多工作。Orbitrap Elite組合式質譜儀的特點是各個模塊、各種參數均可以調節，通過利用各種不同的方法來優化這些參數以達到鑒定的目的。Orbitrap Elite以MSA的方式進行工作，在做磷酸化修飾時肽段上的磷酸根容易發生作用丟失，發生作用丟失后在普通的裂解方式中就會很難檢測到磷酸根，MSA的工作方式保證了在磷酸根丟失后可以自動調整打碎的能量，最后得到打碎前后峰圖的比較，從而提高了磷酸化鑒定的效率，在得到譜圖后可以根據譜圖上顯示的分子量匹配出相應的氨基酸序列，由氨基酸序列在蛋白庫中找到蛋白質。例如在做泛素化的時候，本身作為一個肽段，需要連接到目的肽段上去，導致分量很大，此時就需要高能裂解HCD的方式去將之打碎，這是Orbitrap所特有的。

　　更多閱讀：

　　第一期賽默飛世爾科技質譜用戶沙龍- Obitrap在蛋白質組學中的應用