RTPCR的注意事項

一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用lv 仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被lv 仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。
6. 設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。

二、常用的RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認為是zui有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
因為DEPc不加選擇的修飾蛋白質和RNA，因此在分離和純化RNA過程中不能使用，而且它與一些緩沖液(例如Tri)不能相容。
在所有RNA實驗中，zui關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
研究人員造成的污染 RNA酶zui主要的潛在污染源是研究人員的手。因此進行RNA實驗時應勤換手套。
但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。


（一）動植物總RNA提取-Trizol法
　　Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A) 分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
　　1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。
　　2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入lv 仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。
　　3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。
　　4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。
　　5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會有蛋白質污染，影響比值。
　　 2、加lv 仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
總mRNA的提取(自己的經驗)
一、 關于Trizol Reagent需要的試劑
1． Chloroform：lv 仿 (分析純)
2． Isoproplyl alcohol：異丙醇(分析純)
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。
4． RNase-free water：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃過夜，并高壓滅菌即得（150℃ 3小時）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 關于Trizol Reagent的使用過程：
1． Homogenization（勻漿）
a. Tissues：組織
每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。
b. Cells Grown in monolayer（單層細胞接毒后出現病變的）
針對JEV細胞總RNA的抽提法：
BHK21細胞長成單層后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。出現75%-100%的病變時，以PBS（預冷）沖洗細胞兩次，直接在細胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細胞（細胞瓶有兩種常用規格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細胞瓶而定，以蓋滿瓶底為度，而不是依據細胞的數量，否則可導致DNA的污染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮）
（1）組織接入預冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細胞，置室溫5min，以使核蛋白復合物徹底分離。
（2） 加lv 仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入lv 仿0.2ml），蓋好，劇烈震蕩15s，置室溫2-3分鐘。
（3） 4℃離心，10000g×15min，離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-lv 仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當于所加的Trizol試劑量的60%。
（4） 仔細吸取上層水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。
（6） 4℃離心，10000g×10min。RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。
（7） 棄上清液，加入預冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震蕩，充分洗滌沉淀，4℃離心，5500g×5min。棄上清液，空氣干燥（或真空干燥）后，沉淀重懸于無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA，-70℃保存備用。
（8）抽提出的細胞總RNA干燥后加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結果應為：A260/280 ratio<1.6。
（9） 分離組織10mg（純組織）加800ul Trizol試劑。
（10） 擴增產物的鑒定

DEPC處理方法如下：
1. DEPC處理
（1）DEPC水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。
（2）Tip頭(槍頭）、EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭；EP管和PCR反應管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37℃浸泡過夜，高壓滅菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT
我是用PCR儀來控制溫度和時間的，所以RT是在PCR反應管中作的。
4. 操作過程中要戴一次性手套，并經常換手套。
zui 好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭后，加入1-2ml的0.1轕C水，在滅菌就行了；現在有進口的RNASE FREE的槍頭買，直接用不用處理的

如何消除污染
機器運行完后，取出PCR產物時不能隨便丟棄，應該用塑料手套或其他打結包好后丟入垃圾桶。
（1）試劑：mixer盡量分裝，不要原瓶多次取用。
（2）加樣：原則是DNAzui后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個管子里面，混合均勻之后再分裝到各個管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。
另外，普通實驗室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質粒制備提取都在同一個房間里有比較大的關系，zui容易造成高濃度污染的就是產物的