酵母菌落PCR方法

問：很郁悶，zui近在做電轉畢赤酵母，但是轉化完了沒有合適的篩選方法，如果提基因組的話費時費錢，而且由于我這個電轉的幾率十分低，也就有1%-10%，所以想用菌落PCR方法篩選，但酵母菌破壁很困難，如果處理不好的話基因組釋放不出來，就沒有陽性結果了。

查了一些資料說用反復凍融法，是不是直接挑單菌落就行了呢？還有說用蝸牛酶幫助消化的，這個我倒不是很清楚，所以請各位大蝦們幫幫忙，現在實在是被這個傷透腦筋了！

求助十萬火急！！！！！！！

答： 蝸牛酶提取DNA以后作PCR效果很穩定

酵母DNA的提取

1、x新鮮的菌體中加入150ul（200ul）bufferiI25(30)ul蝸牛酶（30mg/ml），37度，10Min（可以30min水浴，中間隔5分鐘，振蕩一次，避免細胞沉到管底。
　　2、離心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferII250ul
　　3、加入25ul，10%SDS。65度，30min水浴。
　　4、加入25ul 5mol/lKAC，冰浴60分鐘（4度冰箱放置就可以）
　　5、12000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍體積的無水乙醇，混勻放置－20度一小時（可過ye，取出后不要振蕩，直接離心）
　　6、12000rmp，15min，棄上清。
　　7、150ul，bufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min
　　8、將上清溶液轉到干凈的離心管中，加入6ul（10ug/ul），ran酶，37度，30min
　　9、加入等體積異丙醇，4度靜止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中
　　10、如果有蛋白質可以使用酚氯仿抽提
　　11、bufferI：0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA
　　12、bufferII：50mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 
　　13、bufferIII：10mmol/l tris，1mol/l EDTA
　　14、篩選AD/BD可以直接使用抗生素篩選的方法

酵母菌落PCR
　　1、酵母質粒和基因組DNAPCR模版的制備
　　取對數生長期酵母菌株1.5ml，13000r/min，離心15s，去上清，雙蒸水洗滌一次，13000r/min 離心15s，沉淀懸浮于200ulTE緩沖液中，在沸水上煮1-10min，冰浴10min，13000r/min，離心5min，將上清液儲存于－20度取1ul用于PCR
　　2、從平板上調取長勢良好的菌落少許，懸浮于含20ul無菌水的0.5ml eppendofff離心管中（離心管中央預先用注射器針頭扎一個小孔，放置蓋子因受熱膨脹）水浴煮沸0.2.5.10min
　　3、利用微波爐快速制備酵母治理以及菌落取直徑大于3mm的酵母干菌落，至于EP管中蓋上蓋子，在微波爐中加熱，加入30ulTE振蕩，13000r/min，離心2-5min，上清儲存浴－20度，取1ul來作PCR

真菌DNA的提取方法改良
　　1、酵母活化后加入YEPD培養基，25-28度培養16-24小時，收集菌體
　　2、取少許新鮮的菌體，加入0.6ml緩沖液I（0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA）1ml。0.1ml蝸牛酶（30mg/ml），37度溫浴60min
　　3、3000r/min離心10s，去上清，沉淀加入加入bufferII150mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 1ml 10%SDS0.1ml65度，30min水浴。
　　4、加入0.3ml ，5mol/lKAC冰浴60分鐘
　　5、10000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍體積的無水乙醇，混勻放置－20度一小時（可過ye，取出后不要振蕩，直接離心）在5000-6000r/min離心15s　　
　　6、沉淀用0.6ml緩沖液III10mmol/l tris，1mol/l EDTA溶解1000r/min，離心15min
　　7、上清液轉移一個干凈的離心管中，加入6ul10ug/ul），ran酶，37度，30min
　　8、加入等體積異丙醇，4度靜止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中
　　9、如果有蛋白質可以使用酚氯仿抽提

后續試驗思路
　　1、提取酵母DNA
　　2、作PCR
　　3、篩庫的引物（上CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC
　　　　　　　　　下：GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT
　　因為這個引物的TM值很高，所以必須使用二次PCR
　　94度，3min，95度，20miao，68度3min，68度7min，15度15min
　　修改程序94度，3min，95度，25miao，50度25miao，72度1min30s，72度5min
　　4、利用T和B酶切（65度酶切）
　　Taq I（AGCT）  
　　10*Taq I Basal buffer  
　　0.1%bsa  
　　PCR產物  
　　滅菌水  
　　酶  
　　BsuRI(GGCC)  
　　R buffer  
　　模版  
　　滅菌水  
　　酶  
　　5、分出不同的片斷
　　6、將DNA轉到大腸桿菌中，然后提取質粒，測序或是使用抗生素篩選AMP，得到AD，kana得到BD