免疫PCR技術（ImmunoPCR）

免疫PCR技術（Immuno-PCR）

 免疫PCR方法（Immuno-PCR）是Takeshi等1992年將免疫學反應和PCR技術相結合而創建的一種新的檢測技術，具有抗原、抗體反應的特異性和PCR技術的高效性。它運用PCR的高度敏感性來放大抗原抗體反應的特異性，使實驗中只需數百個抗原分子即可檢測，甚至在理論上可檢測到1至數個抗原分子。這種靈敏度使免疫檢測技術達到了一個新的高度。
免疫PCR主要由兩個部分組成：*部分是類似于普通酶聯免疫吸附實驗（ELISA）的抗原抗體反應；第二部分即常規的PCR擴增和電泳檢測。其基本過程如下:首先將待檢測的抗原吸附于固相，經封閉和沖洗后加入特異的抗體，此抗體常采用生物素標記。經孵育和沖洗后加入作為連接分子的親和素或葉綠素，再孵育和沖洗加生物素標記的DNA，孵育和沖洗去除游離的DNA分子，然后加PCR擴增系統放大結合于固相的DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測放大的PCR產物。
近幾年來，科技界陸續提出了免疫基因組學、腫瘤免疫組學、免疫組學、抗原組學、抗原表位組學等新概念。這些概念的提出，表示繼基因組、蛋白質組之后在科學上又一個新領域的產生；對生物技術來說，基因組研究的應用，通過抗原表位組學、抗體組學和抗原表位組學與抗體組學是建立在基因組學和蛋白組學基礎上的新興領域，正在成長為繼基因組和蛋白組后的科學熱點。應用相關的學科的zui新成就，結合相關的技術，經過建立抗原表位庫和抗體庫，高通量篩選抗原靶標和抗原表位，可大大加速診斷、治療藥物靶標的篩選和研究與開發的進程。

1995年，美國科學家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學獎，他所取得的成就是發明了PCR技術。
PCR，中文譯為聚合酶鏈式反應，其實是一種DNA的快速擴增技術，其擴增效率之高就象核裂變的“鏈式反應”那樣。PCR技術通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個小時內把特定的DNA量提高1000萬倍。這種技術一問世，立刻引起了分子生物學研究的一場革命，人們利用這種轟動全世界的技術很快就把微觀領域的生物學研究大大地往前推了一步。可以這么說，PCR技術使分子生物學研究一下子獲得了突破，而且隨著PCR技術的日趨完善，PCR在人類社會生活中的應用也越來越廣泛。比如說在“DNA指紋”中我們提到，科學家們只需要一根頭發甚至一個細胞就可以完成DNA指紋的鑒定工作，這里實際上就要采用PCR技術，因為一個細胞中的DNA含量實在太少了，人們根本不可能檢測到它的指紋；有了PCR技術就好辦了，通過PCR技術把這個細胞中的DNA斷擴增1000萬倍，這樣DNA量就足夠作指紋鑒定了。再比如，在醫院里檢驗血液中的某種病毒，有時病毒量極少（例如有的艾滋病病毒攜帶者），通過傳統的檢查方法費力又費時，這時PCR技術也許就可以幫上忙。可以先選定這種病毒DNA上的一段DNA，設計合適的引物DNA，然后通過PCR技術一擴增很快就可以判斷出血樣中是否擴增出了大量的DNA，如果是的話，那么就說明血樣中帶有該種病毒了。PCR方法不但有極高的靈敏度，而且可以同時一次做近百個擴增反應，省時省力效率高。
PCR技術神奇就神奇在以下幾個特點上：一是被擴增的DNA所需量極小，理論上講一個分子就可以用于擴增了；二是擴增效率高，目的基因的量成指數形式擴增，幾個小時就擴增1000萬倍以上。現在PCR技術已經被廣泛地應用于生命科學研究、食品衛生、醫療、法醫及環境監測等諸多方面，真不愧是“獲得諾貝爾獎”的好技術！

免疫PCR技術（Immuno-PCR）90年代初提出了抗體庫技術。抗體庫技術簡單地說就是用細菌克隆取代B細胞克隆來表達抗體庫（repertoire）。由于RT-PCR技術的發展，大腸桿菌直接表達有功能性抗體分子片斷的成功以及噬菌體顯示技術（phage display）的問世，在90年代初出現噬菌體抗體庫（phage antibody library）技術，該技術使得人們從應用DNA重組技術改造現有的單抗發展到用基因工程技術克隆新的單抗，從而使抗體工程進入一個全新的時期。
噬菌體抗體庫 繼雜交瘤技術之后又一突破性進展的用于制備新型抗體的是噬菌體抗體庫技術。Winter等人在1994年創建了噬菌體抗體庫技術，克服了人體不能隨意免疫的缺點，用人的外周血制備抗體文庫，從而獲得人源性基因工程抗體。而且將抗體基因的克隆和表達融為一體，同在一種載體上進行，將抗體基因表達在載體的表面，用固相化抗原對表達產物的載體進行淘篩（panning），在數日內就可篩選出陽性克隆，從而能構建出大庫容文庫囊括天然全套抗體基因，人們完全可以用基因工程方法研制任何一種具有高度特異性的抗體，使抗體工程的設想成為現實。采用噬菌體抗體庫技術篩選抗體不必進行動物免疫，易于制備稀有抗原的抗體及篩選全人源性抗體、高親和力抗體。同時也將抗體工程的研究推向了新高潮。

1.方法簡單易行，節省時間。可通過發酵生產、大量制備。
2.篩選容量增大，可在數周內篩選100萬-1億個克隆，可獲得高親和力的人源化抗體。
3.可直接從未經免疫的人或小鼠的淋巴細胞中得到抗體基因或IgV區基因，因此可以獲得完全人源化的抗體，克服了人雜交瘤細胞不穩定的缺點，避開了人工免疫和雜交瘤技術。
4.可模仿體內免疫過程，模擬天然全套抗體庫，方便的“制造”和克隆針對任何抗原的抗體。
隨著基因工程抗體技術的發展，在我國有些實驗室開始了噬菌體抗體庫的構建。用抗體庫技術可直接制備人源抗體，例如利用被病原微生物感染的病人外周血細胞制備噬菌體抗體庫，用特定抗原進行篩選，獲得抗乙肝表面抗原、甲肝病毒的人源抗體。抗體庫技術也被用于抗體性能改良，例如用鏈替換方法，以親本抗體的一條鏈（輕鏈）與另一條鏈 （ 重鏈）的文庫組合，構建抗體庫，篩選高親和力的克隆，再固定重鏈，用同樣方法選擇具有更高親和力的輕鏈。一些特異性好、有應用前景的鼠抗體，利用抗原表位定向選擇（EGS）方法，以鼠單抗可變區為模板，經噬菌體展示技術，通過抗原導向，篩選能夠模擬鼠單抗可變區、結合相同抗原決定簇的人抗體，經這一方法獲得人源抗體。國內也有實驗室在計算機輔助設計下，將鼠抗體表面氨基酸殘基“人源化”，主要將鼠 Fv段表面暴露的骨架區殘基中與人Fv不同者改為人源性，使Fv的表面人源化，但仍保留其與抗原結合的特性。目前的問題是，有很多試劑型抗體或診斷用抗體進入市場，而治療用抗體只有少數進入臨床試驗。分析主要原因，一是工程抗體表達量低。國內很多實驗室，真核細胞中抗體表達量在1 毫克／升以下，很難用于生產。僅個別實驗室在對載體進行改造后，抗體表達量達到40毫克／升。二是動物細胞規模化培養技術還不成熟，與國外相比存在很大差距。由于技術和經費等原因，我們動物細胞培養的規模zui大為50升，培養方式大多是采用微載體，懸浮批次和懸浮灌流尚屬空白。在噬菌體抗體庫的基礎上，在近幾年又發展了核糖體展示抗體庫技術。核糖體展示抗體庫技術代表了抗體工程的將來發展趨勢。