PCR）聚合酶鏈式反應

PCR技術可用于：（1）檢驗感染性疾病是否處于隱性或亞臨床狀態;（2）有效檢測癌基因的突變，準確檢測癌基因的表達量;（3）臨床應用于檢測地中海貧血的基因突變。

　　實驗方法原理 PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

　　PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

　　①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備;

　　②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

　　③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

　　重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

　　一、PCR反應的關鍵環節

　　1. 模板核酸的制備。

　　2. 引物的質量與特異性。

　　3. 酶的質量。

　　4. PCR循環條件。

　　二、 PCR常見問題及對策

　　1. 假陰性，不出現擴增條帶

　　（1）模板原因

　　① 模板中含有雜蛋白質。

　　②模板中含有Taq酶抑制劑。

　　③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。

　　④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。

　　⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。

　　（2）酶失活

　　①需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。

　　②忘加Taq酶或溴乙錠。

　　（3）引物

　　①引物質量。

　　②引物的濃度。

　　③兩條引物的濃度是否對稱。

　　解決對策：

　　①選定一個好的引物合成單 位。

　　②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。

　　③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。

　　④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

　　（4）Mg2+濃度

　　①濃度過高降低PCR擴增的特異性。

　　②濃度過低影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

　　（5）反應體積的改變

　　① 通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定;

　　②在做小體積如20 ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

　　（6）物理原因

　　①變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性。

　　②退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率;退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。

　　③擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度有問題。

　　（7）靶序列變異

　　①靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合。

　　②靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列。

　　2. 假陽性，出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

　　（1）引物設計不合適

　　①選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性。

　　②靶序列太短或引物太短。

　　（2）靶序列或擴增產物的交叉污染

　　①整個基因組或大片段的交叉污染。

　　解決方案：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

　　②空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生。

　　解決方案：可用巢式PCR方法來減輕或消除。

　　3. 出現非特異性擴增：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。

　　（1） 引物與靶序列不完全互補或引物聚合形成二聚體。

　　（2） Mg2+離子濃度過高。

　　（3） 退火溫度過低。

　　（4） PCR循環次數 過多有關。

　　（5） 酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。

　　其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

　　4. 出現片狀拖帶或涂抹帶

　　（1）原因

　　① 酶量過多。

　　②酶的質量差。

　　③dNTP濃度過高。

　　④Mg2+濃度過高。

　　⑤退火溫度過低。

　　⑥循環次數過多引起。

　　（2）對策

　　①減少酶量。

　　②調換另一來源的酶。

　　③減少dNTP的濃度。

　　④適當降低Mg2+濃度。

　　⑤增加模板量。

　　⑥減少循環次數。