志賀氏菌屬,熒光定量,PCR檢測試劑盒實驗操作步驟

名稱：志賀氏菌屬,熒光定量,PCR檢測試劑盒

實驗操作步驟
1. DNA提取：取增菌液1mL加到1.5mL無菌離心管中，10,000rpm離心5min，棄去上清；加入50μL DNA提取液，充分混勻后沸水浴5 min，13,000rpm離心5min，取上清液進行檢測或保存于-20℃以待檢測。
2. 擴增試劑準備（在試劑貯存和準備區完成）
2.1. 從試劑盒中取出PCR反應液，冰盒上融化后混勻。試劑在使用前2000rpm離心20s備用。
2.2. 設需要的PCR反應管管數為N（N = 待檢樣本數+ 1管陰性對照 +1管陽性對照）。
2.3. 混合液的配制：首先吸取體積為22.6（μL）×N反應液至1.5mL滅菌離心管，再加入Taq DNA聚合酶0.4 （μL）×N，混勻后2000rpm離心20s，然后向N 個0.2mL PCR反應管中分裝已加入Taq酶的混合液23μL/每管，蓋緊管蓋。
2.4. 注意：陰性對照管建議在此區中加入2μL陰性對照樣品。
3. 加樣（在樣品制備區完成）
3.1. 陽性對照取出解凍，使用前2000rpm 離心20s。
3.2. 將保存在-20℃的核酸提取物置室溫解凍，以13,000rpm離心5min；向N個PCR管中分別加入待檢樣本DNA（包括陽性對照）2μL，蓋緊管蓋，2000rpm離心20s，將PCR反應管轉移至核酸擴增區。注意做好樣品號標記。
4. PCR擴增（在核酸擴增區完成）
4.1. 上機前應檢查各反應管是否蓋緊。
4.2. 反應體系設為25μL；熒光信號采集設定在退火溫度。對于多通道熒光PCR儀，選擇熒光素FAM為信號采集通道。
4.3. PCR循環參數為：*階段，95℃ 3 min預變性；
第二階段，[95℃ 10s；60℃ 40s] × 40次循環。
注意：在Roche的LightCycler上使用，變性溫度95℃改為93℃，其他不變。
5. 質量控制標準及結果判斷
5.1 綜合分析儀器給出的各項數據及擴增曲線，設定合理的閾值（Threshold）和基線（Baseline），使儀器給出正確的結果。
5.2 陰性對照CT值應顯示為0或≥40.0，陽性對照的CT值應≤30.0，否則視實驗失敗，需重做。
5.3 檢測樣品CT≤35.0，結果有效，可直接報告樣品陽性。
5.4 檢測樣品35.040.0，需進行一次重復實驗，若CT仍介于35.0和40.0之間，且曲線有明顯的指數增長特性，同時陰性對照Ct值為零，可報告樣品陽性，否則報告樣品陰性。
5.5 檢測樣品CT值為零，報告樣本陰性。