PCR實驗常見問答

常見問答
Q-1: 
LA PCR的反應條件? 
A-1: 
因擴增片段的大小、反應體積、使用擴增儀器的不同而不同。
◇ 循環次數
根據模板DNA的量以及擴增片段的大小，設定25 ~ 30個循環。
如果循環次數太少，擴增量不足；如果循環次數太多，則會出現Smear。

 
◇ Anneal以及Extension
合適的Anneal溫度通常在45 ~ 68℃之間 （預備實驗可2℃間隔進行）。另外，由于TaKaRa LA Taq 在60 ~ 68℃間也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內設定Anneal-Extension溫度, 進行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時，每kbp大體可設定30秒 ~ 1分鐘；當溫度設定在68℃以下時, 時間設定可稍長一些。通常，Anneal溫度太高，有時會得不到擴增產物；Anneal溫度太低時，容易發生非特異性反應。另外，Extension時間太短時，會得不到擴增產物或者會有一些短的非特異性產物優成；而Extension時間太長時，會出現Smear。
 
  
Q-2: 
選擇LA PCR引物 （Primer） 時的注意事項? 
A-2: 
特異性非常重要。20mer左右的Primer, 如果特異性高，擴增20 kbp沒有問題，但如果可能的話，建議設計30 ~ 35mer左右。使用特異性低的Primer時，會出現很多非特異性產物。 
  
Q-3: 
LA PCR時酶的使用量? 
A-3: 
50 μl的反應體系可使用2.5 U的TaKaRa LA Taq。但合適的用量也與模板DNA的量及Complexity、擴增片段大小有關。酶量過多時，易發生非特異性反應，出現Smear；而酶量過少時，反應性能下降。
 
  
Q-4: 
LA PCR時模板DNA的調制方法? 
A-4: 
模板DNA的質量是LA PCR成功與否的重要因素。擴增超過10 kbp的DNA片段時，用簡單的方法 （例如Cell只經過加熱處理或Protease處理） 調制的DNA作模板不太合適， 建議使用充分精制的完整的DNA （沒有Nick等）。
 
  
Q-5: 
是否可以對λ 噬菌體直接進行LA PCR反應? 
A-5: 
可以。99℃、10 min處理后的噬菌體約106 ~ 107 pfu作為模板，至少可擴增8 kbp的DNA片段。 
  
Q-6: 
對Mammalian cell或E. coli 只進行熱處理 （98℃， 2 min） 或Protease處理的樣品可否進行LA PCR?
 
A-6: 
◇ 對E. coli只進行熱處理可擴增10 kbp的DNA片段 （50 ml PCR反應液中37℃ Overnight culture in L-both 使用2 μl）。 
◇ Human細胞 （培養細胞） 如只經過熱處理，可擴增數百bp；經過Protease處理、 熱處理后的樣品，zui多可擴增1 ~ 2 kbp。所以，如果要擴增長鏈DNA，建議使用經過充分精制的完整的DNA作模板。
 
  
Q-7: 
使用LA Taq是否也產生A的Overhang? （PCR產物是否可直接克隆于T-vector中?） 
A-7: 
可以。使用TaKaRa LA Taq 及TaKaRa Ex Taq 時的PCR產物產生A的Overhang，與使用TaKaRa Taq 時的PCR產物克隆于T-vector 的效率基本相同。