PCR檢測方法

PCR反應的zui大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。

污染原因

一、標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

二、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

三、PCR擴增產物污染：這是PCR反應中zui主要zui常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

四、實驗室中克隆質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。

污染的監測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

對照試驗

一、陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照。

二、陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括：

1.標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。

2.試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

三、重復性試驗。

四、選擇不同區域的引物進行PCR擴增。

防止污染的方法

一、 污染的預防

進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，zui大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。

1.劃分操作區：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行：

（1）標本處理區，包括擴增摸板的制備。

（2）擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增。
（3）產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。

（4）各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。

切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。

2.分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：

（1） PCR用水應為高壓的雙蒸水。

（2） 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制。

（3）引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。

3. 實驗操作注意事項：盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：

（1）戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。

（2）使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。

（3）避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。

（4）操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度。

（5）zui后加入反應模板，加入后蓋緊反應管。

（6）操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性。

（7）盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器zui容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，zui好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區。

（8）重復實驗，驗證結果，慎下結論。

二、追蹤污染源

如果不慎發生污染情況，應從下面幾條出發，逐一分析，排除污染。

1.設立陰陽性對照：有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照，100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應所需的全部成分，而不加模板DNA,這對監測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果，就是某一種或數種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。
2.環境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發現試劑被污染了，如果預防措施比較嚴密，則考慮可能為環境污染。環境污染中常見的污染源主要有：

（1）模板提取時真空抽干裝置。

（2）凝膠電泳加樣器。

（3）電泳裝置。

（4）紫外分析儀。

（5）切膠用刀或手術刀片。

（6）離心機。

（7）冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等。此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源：

（a）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源。（b）0.1ml去離子水浸泡。（c）取5ml做PCR實驗。（d）電泳檢測結果。

（8）氣溶膠。

如果經過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產物的氣溶膠造成的，此時就應該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設計新的引物（與原引物無相關性）。

三、污染處理

1.環境污染

（1）稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。

（2）紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產物污染時，要考慮PCR產物的長度與產物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照射時，PCR產物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內的交聯和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點的數量與二聚體位點相當。如果這些位點（0.13/堿基）在DNA分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。

2.反應液污染

可采用下列方法之一處理：

（1）DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室溫反應30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA的序列。

（2）內切酶法：選擇識別4個堿基的內切酶（如Msp I和Taq I等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR。

（3）紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV照射法。

（4）g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA,2.0 kGy可破壞104拷貝的質粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR,但高于此限度會使PCR擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過水的離子化產生自由基來破壞DNA的。
3.尿嘧啶糖苷酶（UNG）法

由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。

（1）原理：在PCR產物或引物中用dU 代替dT.這種dU化的PCR產物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。

（2）dUTP法：用dUTP代替dTTP,使產物中摻入大量dU.在再次進行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產物的殘留污染。由于UNG在PCR循環中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產物。

（3）dU引物法：合成引物時以dU 代dT,這樣PCR產物中僅5ˊ端帶dU.UNG處理后，引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb以上）的擴增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。dU引物zui好將dU設計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。

（4）優點：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴增在同一個反應管內進行；由于擴增產物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。

（5）需注意的是摻入dUTP的DNA不應對產物的任何操作有影響，在進行PCR產物克隆時，應該轉化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉化產物會被受體菌UNG消化掉。

4. 固相捕獲法

用于去除標本中污染的核酸和雜質，原理如下：

（1）用一生物素標記的單鏈RNA探針與待擴核酸雜交，雜交區域是非擴增區。

（2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產物和雜質。

（3）洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA探針雜交區域。第（2）步的漂洗后可用PCR檢測以確定標本是否被擴增產物或重組質粒污染。

5.RS-PCR法（RNA-specific PCR）

也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關鍵在于設計引物，逆轉錄引物的3ˊ端（A區）有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個核苷酸（C區）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉錄后，經超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物（C）以*鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,以后的PCR循環中用逆轉錄引物的B區和引物C進行擴增加尾cDNA,而污染的DNA或質粒DNA才不會被擴增。

6.抗污染引物法

該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質粒的位點。這一區域只存在完整的原病毒中，在重組質粒中，這一區域分成兩個區域與克隆位點被。如果重組質粒污染了標本，也不能擴增出任何條帶，即使出現了擴增帶，其大小也與預期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增，因此只要出現預期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的，該法試用于環狀靶分子系列。