抑制PTEN磷酸化可增強成膠質細胞瘤的放療敏感性

　　PTEN (gene of phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten)是腫瘤抑制基因，其編碼的具有磷酸酯酶活性的蛋白，是機體維持正常生理功能所必須的因子。作為腫瘤抑制基因，PTEN對受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K )/蛋白激酶B(Akt)信號通路的調節起著關鍵作用。在體內，PTEN可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，從而引發級聯反應，影響細胞增殖、代謝，進而抑制腫瘤的發生發展【1】。

　　癌癥和腫瘤基因圖譜（Cancer Genome Atlas, TCGA）結果表明，PTEN與成膠質細胞瘤之間存在很高的相關性。在成膠質細胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）的治療中，由于PTEN的缺失或突變而造成的AKT信號通路異常活化使得細胞對酪氨酸激酶抑制劑產生耐藥性，影響治療效果。在細胞質中PTEN往往作為脂質磷酸酶參與調節細胞增殖和存活發揮的作用，而在細胞核內，PTEN則在調控基因組穩定性、細胞周期進程，以及染色質重塑等方面扮演著重要的角色（下圖）【1】。

　　成膠質細胞瘤是成人中發生率最高的顱內腫瘤，具有極高的侵襲性及神經破壞性。腦局部放射治療（ionizing radiation，IR）是目前較為有效的治療方法之一。IR消滅癌細胞的原理，主要是通過高劑量的輻射造成細胞內大量的DNA斷裂，過度的DNA損傷累積超出了細胞自身的修復能力范圍，從而導致癌細胞死亡。但是腫瘤細胞抗輻射性的存在使得放療效果收效微弱，而其潛在的機制尚不明確【2】。

　　近幾年研究表明，PTEN發生的翻譯后修飾例如SUMO化，磷酸化，泛素化等等也會對PTEN的功能造成影響。2012年，加州大學圣地亞哥分校Frank B. Furnari組就在PNAS上報道了經過標準的藥物治療輔以放療的成膠質細胞瘤病人樣品中，普遍存在著PTEN 第240位酪氨酸的磷酸化修飾(pY240-PTEN)，并且這種修飾與病人較短的生存時間存在著密不可分的聯系【3】。

　　那么pY240-PTEN是否會對細胞DNA損傷應答修復產生影響從而造成癌細胞對治療產生耐受作用呢？

　　近日，Frank B. Furnari組延續先前的工作，在Cancer Cell上在線發表了題為Inhibition of Nuclear PTEN Tyrosine Phosphorylation Enhances Glioma Radiation Sensitivity through Attenuated DNA repair的研究論文，闡述了FGFR2可通過調節PTEN第240位酪氨酸磷酸化，促進pY240-PTEN與Ki-67在染色質上的結合從而招募重組酶RAD51促進成膠質細胞瘤細胞的DNA損傷修復，使癌細胞可以更好的應對放射治療。

　　在本文中，研究人員首先分析了19例臨床成膠質細胞瘤樣本，發現pY240-PTEN含量較高的樣本其DNA損傷修復進程與含量低的樣本相比更快（以DNA損傷修復起始信號pH2AX作為指征），表明pY240-PTEN可能影響了DNA修復。基于此，研究人員體外構建野生型WT-PTEN和第240位酪氨酸點突變為苯丙氨酸而無法被磷酸化的Y240F-PTEN蛋白進行激酶反應，發現Y240-PTEN可直接被激酶FGFR2磷酸化。為進一步證明pY240-PTEN能夠促進DNA修復，研究人員通過比較穩轉了WT-PTEN和突變Y240F-PTEN的U87（PTEN null）成膠質細胞瘤細胞在IR處理后DNA雙鏈斷裂情況，發現WT-PTEN細胞DNA損傷程度較低。

　　DNA雙鏈斷裂對機體來說是最為致命的損傷。為了應對這種損傷，機體演化出了兩種主要的雙鏈斷裂修復途徑，一種是低保真的非同源末端連接修復（non-homologous end -joining, NHEJ），一種是高保真的同源重組修復(homologous recombination, HR)。通常，細胞主要選擇HR對雙鏈斷裂進行修復，在這過程中重組酶RAD51能否正常被招募至損傷位點，是HR修復成功的關鍵之一。研究人員通過免疫熒光染色及報告系統試驗發現在穩定表達Y240F-PTEN的細胞內存在著較WT-PTEN細胞更為有效的HR修復。

　　上述結果表明FGFR2通過磷酸化Y240-PTEN促進RAD51的招募從而增強DNA修復效率使細胞免于損傷帶來的危害。另外，研究人員對來源于病人樣本的成膠質細胞瘤干細胞的分析也表明了FGFR2調節的Y240-PTEN磷酸化對細胞在IR處理后存活至關重要。

　　緊接著，研究人員發現盡管PTEN在核質中均有分布，但主要是細胞核內分布的PTEN發生了Y240磷酸化。染色質結合蛋白分離實驗發現WT-PTEN能夠結合染色質并且IR處理能增強這種結合，同時也伴隨著pY240和RAD51水平的上調。檢測IR處理6h后H3K9me3（染色質凝集標志）水平發現在WT-PTEN細胞內其水平降低，亦說明PTEN結合染色質可以促進其松弛，以保證DNA修復蛋白能夠進入損傷處。與此同時，研究人員在U87細胞中分別轉入了磷酸酶功能缺失的G129R-PTEN和C124S-PTEN突變體，驗證了pY240-PTEN在DNA修復中的作用依賴于自身的磷酸酶活性。

　　PTEN缺少DNA結合結構域，那么是什么因子在PTEN與染色質結合之間起到聯系橋梁的作用呢？通過質譜分析以及體外驗證實驗，研究人員確定了Ki-67（細胞增殖標志蛋白）為PTEN結合染色質的聯系蛋白，并且pY240-PTEN是通過結合Ki-67上的PP1-BD（protein phosphatase 1-binding domain）結構域從而被招募至染色質上發揮作用。

　　更進一步的研究表明，原位移植EGFRvIII/Y240F-PTEN星形膠質瘤細胞的Y240F knock-in小鼠較移植了EGFRvIII/WT-PTEN星形膠質瘤細胞的小鼠而言小鼠存活時間延長，成瘤能力下降。采用FGFR抑制劑對移植了成膠質細胞瘤細胞的小鼠進行處理，在這之后結合IR處理，腫瘤細胞生長明顯受到了抑制。這些結果也為臨床研究中利用FGFR抑制劑對GBM患者有針對性的結合放射治療提供了有效的理論支持。

　　總而言之，上述工作闡明了成膠質細胞瘤中pY240-PTEN的存在是腫瘤細胞以產生DNA損傷為目的的治療方式存在耐受性的原因。通過阻斷Y240-PTEN的磷酸化或許能夠提高腫瘤細胞對放射治療的敏感性從而為疾病治療帶來新的福音。

　　原文鏈接：

　　https://www.cell.com/cancer-cell/pdfExtended/S1535-6108(19)30054-6

　　參考文獻

　　1. Milella, M., Falcone, I., Conciatori, F., Cesta Incani, U., Del Curatolo, A., Inzerilli, N., Nuzzo, C.M., Vaccaro, V., Vari, S., Cognetti, F., and Ciuffreda, L. (2015). PTEN: multiple functions in human malignant tumors. Front. Oncol. 5, 24.

　　2. Bao, S., Wu, Q., McLendon, R.E., Hao, Y., Shi, Q., Hjelmeland, A.B., Dewhirst, M.W., Bigner, D.D., and Rich, J.N. (2006). Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature 444, 756–760.

　　3. Fenton, T.R., Nathanson, D., Ponte de Albuquerque, C., Kuga, D., Iwanami, A., Dang, J., Yang, H., Tanaka, K., Oba-Shinjo, S.M., Uno, M., et al. (2012). Resistance to EGF receptor inhibitors in glioblastoma mediated by phosphorylation of the PTEN tumor suppressor at tyrosine 240. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 109, 14164–14169.