變性梯度凝膠電泳

1. 變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱之為變性。核酸50%發生變性時的溫度稱為熔解溫度（Tm）。Tm值主要取決于DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下：溫度50-60 ℃，變性劑0-100%。當一雙鏈DNA片段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時，此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當于此段DNA的低熔點區的Tm值，此區便開始熔解，而高熔點區仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發生改變，達到分離的效果。Tm的改變依賴于DNA序列，即使一個堿基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以及少于10個堿基的缺失突變。

2. 為了提高DGGE的突變檢出率，可以人為地加入一個高熔點區GC夾。GC夾（GC clamp）就是在一側引物的5′端加上一個30-40bp的GC結構，這樣在PCR產物的一側可產生一個高熔點區，使相應的感興趣的序列處于低熔點區而便于分析。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%。

3.  作為一種突變檢測技術，DGGE具有如下的優點：（1）突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。（2）檢測片段長度可達1kb，尤其適用于100-500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素摻入，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。（4）操作簡便、快速。DGGE一般在24小時內即可獲得結果。（5）重復性好。但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴。

DNA樣品

尿素去離子甲酰胺丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺瓊脂糖 

PCR擴增儀變性梯度凝膠電泳儀凝膠成像及分析系統紫外透射儀高速離心機電泳儀電泳槽微量加樣器Tip頭Tip頭盒Eppendorf管Eppendorf管架

1.PCR反應

其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。

2.PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認。

3.垂直變性梯度凝膠電泳

變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0-100%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的最適解鏈條件（即變性濃度）。

PCR產物加上樣緩沖液后上樣，300-400μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間2-4小時。

4.平行變性梯度凝膠電泳

變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區域的變性濃度，制備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測各標本是否存在突變。

PCR產物加上樣緩沖液后，25μl-30μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間3-6小時。

5.染色5分鐘，凝膠成像儀分析結果。

1.  在混合和灌膠時應避免產生氣泡。

2.  有溶液應保存于4℃棕色瓶中，一般幾個月到一年內有效。

3. 電泳時凝膠溫度必須保持恒定，要達到這一要求，可把膠板浸沒于充分攪拌的溫控緩沖液槽內。對于缺乏變性劑時比較容易變性的DNA 來說，槽內的溫度選擇在60℃稍微超過熔點，并且大部分的工作都在60℃下進行（但溫度稍高或低一點都可采用）。溫度保持恒定可將電泳緩沖液加熱到60℃，并把膠浸入其中進行電泳即可。

4.該實驗中提取DNA，以及DGGE操作中接觸到得很多藥品都有毒，還有致癌、變性等毒害，一定要嚴格操作，做好防護保護自己。

一、實驗過程中的操作細節：

1. 點樣的時候最好用微量進樣器，避免污染和樣品漂浮。

2. 為避免邊緣效應，兩邊可以一定點一些樣品。

3. 制膠是關鍵。玻璃板一定要洗干凈，在灌膠時，要勻速的轉動滑輪，將凝膠液勻速的灌入玻璃板中，液面要保持水平。

二、實驗結果的評估

DGGE圖譜很模糊，只有很少的幾個條帶，可能是因為變性膠濃度不合適而導致產物結果無法完全呈現在圖譜上。除此外，也可能是因為樣品量過低而導致圖譜模糊。在實驗過程中中，操作過程、膠的均勻程度、玻璃板的潔凈程度等都會影響電泳的結果。